不同阿片类药物对荷瘤小鼠细胞免疫的影响

杨雅婷 顾希垚 苏殿三 孙加晓 谢文钦

长期的临床实践发现，20%～25%的肿瘤TNM Ⅰ或Ⅱ期患者术后出现复发和转移[1-2]。转移和复发是恶性肿瘤的特征[3]。肿瘤的病理学检查结果可以预测肿瘤患者术后的预后，然而临床有部分肿瘤患者即使术后病理学检查结果为切缘阴性，仍会发生肿瘤转移和复发。全身麻醉肿瘤手术后复发率升高的原因不明，阿片类药物的使用是肿瘤切除术后导致肿瘤复发的因素之一，并且越来越受到临床医师的重视[4-7]，但其促进肿瘤恶性生物学行为致其复发的机制目前尚不清楚。近年来的研究[1,8-9]结果表明，细胞免疫在肿瘤的形成、转移和复发过程中具有重要作用。阿片类药物可能通过抑制机体的细胞免疫，促进肿瘤的转移和复发[10-11]。

本研究通过建立balb/c小鼠皮下结肠癌模型，观察目前常用的3种阿片类药物羟考酮、舒芬太尼和芬太尼对荷瘤小鼠免疫细胞组成比例和血清细胞因子的影响，经比较后筛选出对免疫抑制比较小的阿片类药物，以期在围术期和癌症镇痛治疗中选择更为合适的镇痛药物。

1 材料与方法

1.1 实验动物 83只6～8周无特定病原体(SPF)级balb/c小鼠，体重25～30 g，均购自南京军区福州总院转化医学中心。饲养条件：温度维持在24 ℃左右，湿度40%～60%，自由饮水、进食，12 h昼夜交替照明。

1.2 主要试剂和仪器 小鼠结肠癌细胞系(CT26)购自中国科学院细胞库/干细胞库。羟考酮(HamoL Limited，批号BR171)，舒芬太尼(宜昌人福药业有限责任公司，批号1170906)，芬太尼(宜昌人福药业有限责任公司，批号1160602)。CD3-异硫氰酸荧光素(FITC，批号11-0032-82)、CD4-异构藻青蛋白(APC，批号17-0041-82)、CD8-藻红蛋白(PE，批号12-0081-82)、CD49b-FITC(批号11-5971-82)均购自美国eBioscience公司，红细胞裂解液(美国BD公司，批号555899)，小鼠辅助性T淋巴细胞(Th)1/Th2/Th17细胞因子试剂盒(检测IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A含量，美国BD公司，批号560485)。台式低温高速离心机(德国Beckman Coulter公司)，流式细胞仪(荧光激活细胞分类仪FACS)BD FACS Verse(美国BD公司)。

1.3 小鼠结肠癌模型的建立 将胰酶消化下的小鼠结肠癌细胞系CT26稀释为1×107/mL，用注射器抽取0.2 mL，接种于小鼠的右侧腹股沟，接种完用棉球按压片刻以防细胞漏逸。14 d后，小鼠皮下如见黄豆大小的肿块形成，则表明模型构建成功。

1.4 药物处理 接种肿瘤细胞的第2天，采用随机数字表法将40只小鼠分成4组：对照组(9只)，羟考酮组(11只)，芬太尼组(9只，原10只死亡1只)，舒芬太尼组(10只)。每日观察小鼠的精神、活动状态、饮食和大小便，并称重。接种肿瘤细胞后第14天开始在小鼠的尾静脉注射药物，每天早、晚8点各1次，连续3 d。每只小鼠每次注射0.2 mL液体，对照组为0.9%氯化钠溶液，羟考酮组为5 mg/kg羟考酮，舒芬太尼组为5 μg/kg舒芬太尼，芬太尼组为50 μg/kg芬太尼[12-13]。

1.5 标本处理和淋巴亚群检测 小鼠于最后1次注射药物后12 h，予氯胺酮麻醉后眼球取血800 μL。断颈处死小鼠后解剖取脾，经200目过滤网研磨成脾细胞悬液。外周血采用红细胞裂解法获得淋巴细胞。每管各取100 μL EDTA-K2抗凝外周血，加入CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE 3个荧光标记的单克隆抗体，避光，4 ℃孵育30 min后，加入1 mL红细胞裂解液，混匀，室温避光5 min，以300×g、4 ℃离心5 min，然后弃上清液，加入2 mL FACS缓冲液(荧光激活细胞分类仪FACS)洗涤，再以300×g低温4 ℃离心5 min。重复洗涤离心1次，最后以500 μL含1%多聚甲醛的PBS重悬。检测外周血和脾悬液中淋巴细胞亚群CD3+T淋巴细胞的比例、CD3+CD4+Th细胞的比例、CD3+CD8+T淋巴细胞的比例和CD4/CD8比值。另各取100 μL外周血和脾悬液，加入CD49b-FITC，具体操作步骤同上。检测外周血和脾脏中自然杀伤细胞(NK细胞)占淋巴细胞的比例。

1.6 血清细胞因子检测 剩余43只小鼠按前述方式造模和给药：对照组(9只)，羟考酮组(10只)，芬太尼组(14只)，舒芬太尼组(10只)。促凝管收集外周血，静置1 h后以2 000×g、4 ℃离心15 min，收取血清于-80 ℃冻存，应用Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A含量，操作步骤按照试剂盒说明书进行，均在福建医科大学流式细胞仪分析室上机检测。

2 结 果

2.1 不同阿片类药物对外周血淋巴细胞亚群分布的影响 各组间CD3+T淋巴细胞的比例的差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，羟考酮组、舒芬太尼组和芬太尼组的CD3+T淋巴细胞比例分别降低2.21%、19.21%和23.52%，舒芬太尼组和芬太尼组与对照组的差异均有统计学意义(P值均<0.01)；羟考酮组的CD3+T淋巴细胞比例也显著高于舒芬太尼组和芬太尼组(P值均<0.01)，而舒芬太尼组与芬太尼组间差异无统计学意义(P>0.05)。各组间CD3+CD4+Th细胞的比例的差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，羟考酮组、舒芬太尼组和芬太尼组的CD3+CD4+Th细胞比例分别降低0.93%、19.67%和24.64%，舒芬太尼组和芬太尼组与对照组的差异有统计学意义(P值均<0.01)；羟考酮组的CD3+CD4+Th细胞比例也显著高于舒芬太尼组和芬太尼组(P值均<0.01)，而舒芬太尼组与芬太尼组间差异无统计学意义(P>0.05)。各组间CD3+CD8+T淋巴细胞的比例的差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，羟考酮组、舒芬太尼组、芬太尼组CD3+CD8+T淋巴细胞比例分别降低3.87%、21.07%和21.98%，舒芬太尼组和芬太尼组与对照组的差异均有统计学意义(P值均<0.01)；羟考酮组的CD3+CD8+T淋巴细胞比例也显著高于舒芬太尼组和芬太尼组(P值均<0.05)，而舒芬太尼组与芬太尼组间差异无统计学意义(P>0.05)。各组间NK细胞占淋巴细胞的比例的差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，羟考酮组、舒芬太尼组、芬太尼组的NK细胞占淋巴细胞比例分别降低16.45%、29.53%、34.19%，舒芬太尼组和芬太尼组与对照组的差异有统计学意义(P值分别<0.05、0.01)；羟考酮组的NK细胞占淋巴细胞比例显著高于芬太尼组(P<0.05)，舒芬太尼组与芬太尼组间差异无统计学意义(P>0.05)。各组间CD4/CD8比值的差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组外周血淋巴细胞亚群分布比较

组别NCD3+T淋巴细胞CD3+CD4+Th细胞CD3+CD8+T淋巴细胞CD4/CD8NK细胞对照90.721±0.0160.571±0.0150.129±0.0044.51±0.160.172±0.018羟考酮110.705±0.0200.566±0.0190.124±0.0074.24±0.250.144±0.009舒芬太尼90.582±0.018①③0.459±0.020①③0.102±0.005①④4.42±0.360.121±0.010②芬太尼100.551±0.016①③0.431±0.016①③0.101±0.004①④4.11±0.200.113±0.006①④

与对照组比较：①P<0.01，②P<0.05；与羟考酮组比较：③P<0.01，④P<0.05

2.2 不同阿片类药物对脾脏中淋巴细胞亚群分布的影响 各组间CD3+T淋巴细胞的比例的差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，羟考酮组、舒芬太尼组CD3+T淋巴细胞比例分别增加22.13%和20.84%，差异均有统计学意义(P值均<0.01)，而芬太尼组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)；羟考酮组的CD3+T淋巴细胞的比例显著高于芬太尼组(P<0.05)。各组间CD3+CD4+Th细胞的比例的差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，羟考酮组、舒芬太尼组CD3+CD4+Th细胞的比例分别增加18.42%和21.54%，差异均有统计学意义(P值均<0.01)，芬太尼组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)；羟考酮组与芬太尼组间CD3+CD4+Th细胞比例的差异无统计学意义(P>0.05)。各组间CD3+CD8+T淋巴细胞的比例的差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，羟考酮组、舒芬太尼组CD3+CD8+T淋巴细胞比例分别增加26.81%和25%，差异均有统计学意义(P值均<0.01)，芬太尼组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)；羟考酮组的CD3+CD8+T淋巴细胞比例显著高于芬太尼组(P<0.05)。各组间NK细胞占淋巴细胞的比例的差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，羟考酮组、舒芬太尼组、芬太尼组NK细胞占淋巴细胞比例分别减少30.67%、28.36%、31.92%，与对照组的差异均有统计学意义(P值分别<0.01、0.05)。各组间CD4/CD8比值的差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别NCD3+T淋巴细胞CD3+CD4+Th细胞CD3+CD8+T淋巴细胞CD4/CD8NK细胞对照90.270±0.0070.179±0.0050.066±0.0032.79±0.090.091±0.007羟考酮110.330±0.012①0.212±0.009①0.083±0.004①2.60±0.080.063±0.004①舒芬太尼90.327±0.016①0.218±0.011①0.082±0.004①2.70±0.090.065±0.006②芬太尼100.277±0.018③0.182±0.0130.068±0.005③2.70±0.110.062±0.006①

与对照组比较：①P<0.01，②P<0.05；与羟考酮组比较：③P<0.05

2.3 不同阿片类药物对血浆中细胞因子表达的影响 各组间IFN-γ含量的差异无统计学意义(P>0.05)。各组间TNF-α含量的差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，羟考酮组、舒芬太尼组和芬太尼组的TNF-α含量均显著降低(P值均<0.01)，芬太尼组又显著低于羟考酮组和舒芬太尼组(P值均<0.01)。各组间IL-6含量的差异无统计学意义(P>0.05)。各组间IL-10含量的差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，羟考酮组和舒芬太尼组的IL-10含量均显著升高(P值均<0.05)，而芬太尼组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。各组间IL-17A含量的差异无统计学意义(P>0.05)。各组间Th1/Th2比值的差异有统计学意义(P<0.01)。与对照组相比，芬太尼组的Th1/Th2比值显著降低(P<0.01)，羟考酮组和舒芬太尼组虽有降低的趋势，但差异均无统计学意义(P值均>0.05)；芬太尼组的Th1/Th2比值也显著低于羟考酮组和舒芬太尼组(P值均<0.05)。见表3。IL-2和IL-4含量因检测值极低，故未进行统计学处理。

组别NIFN-γ(pg/mL)TNF-α(pg/mL)IL-6(pg/mL)IL-10(pg/mL)IL-17A(pg/mL)Th1/Th2对照93.22±1.3417.79±2.5010.75±2.052.42±0.630.86±0.181.58±0.08羟考酮105.31±2.788.54±1.70①③10.76±4.004.51±0.62②1.01±0.211.14±0.28④舒芬太尼145.54±2.358.61±1.32①③6.69±1.584.95±0.63②1.26±0.191.25±0.31④芬太尼101.93±0.343.85±0.38①9.13±1.513.52±0.260.90±0.170.53±0.65①

与对照组比较：①P<0.01，②P<0.05；与芬太尼组比较：③P<0.01，④P<0.05

3 讨 论

肿瘤免疫相关的研究多集中在肿瘤局部的免疫，而全身的免疫系统可以监测循环系统中的肿瘤细胞和抗原，在预防肿瘤转移和进展中更具有临床意义[14]。本研究比较了3种临床常用的阿片类药物羟考酮、芬太尼和舒芬太尼对于荷结肠癌balb/c小鼠外周血和脾脏淋巴细胞组成比例和血清细胞因子的影响，结果发现，相比于等效镇痛剂量的芬太尼和舒芬太尼，5 mg/kg羟考酮对外周血中淋巴细胞比例的影响更轻微。

CD3、CD4、CD8是胸腺免疫细胞早期的分化抗原标志，经过阳性选择和阴性选择，发育成熟的胸腺细胞才能进入外周血。最近北京大学张泽民研究团队对来自12例结直肠癌初治患者外周血、癌组织和癌旁组织中的大量T淋巴细胞进行了单细胞全长转录组测序和分析，发现外周血中的CD4+T淋巴细胞以初始T淋巴细胞和效应细胞为主；CD8+T淋巴细胞以初始T淋巴细胞、中枢记忆细胞和最近活化的效应T淋巴细胞为主[15]。适应性免疫系统中，CD3+CD4+Th细胞是机体最主要的辅助抗肿瘤细胞，而CD3+CD8+T淋巴细胞是发挥杀伤肿瘤细胞的主力军[16]。新的研究发现，全身免疫包括外周血、脾脏等的CD4+T淋巴细胞亚群对于抗肿瘤免疫应答是必不可少的，甚至比CD8+T淋巴细胞更重要。Spitzer等[17]的研究结果表明，从治疗成功的小鼠体内提取免疫反应性CD4+T淋巴细胞注射到未治疗动物的肿瘤中，与注射CD8+T淋巴细胞相比，其可以发挥更长时间的保护作用。他们通过新开发的scaffold平台，发现CD4+T淋巴细胞在协调、统筹全身各系统抗肿瘤免疫中发挥了主要作用。本研究观察了3种阿片类药物对CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+Th细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞比例的影响，发现羟考酮对外周血免疫的影响较小，其在脾脏中甚至具有促进免疫的作用，而应用等效剂量的舒芬太尼和芬太尼后，外周血中这3类细胞的比例均有不同程度的下降。这与Ma等[18]在体外研究中观察到的芬太尼呈剂量依赖性地降低脐带单个核细胞中的CD4+、CD8+细胞的百分比和数量的结果相同。

本研究结果显示，各组外周血和脾脏中CD4/CD8比值的差异均无统计学意义，进一步说明阿片类药物并不是通过特异性地消耗或增殖CD4+或CD8+这一类型的细胞而改变CD3+CD4+Th细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞所占淋巴细胞的比例，而可能是通过影响胸腺中的细胞发育成熟[19-20]或提高外周血中异常细胞的比例，甚至是改变淋巴细胞的归巢和迁移实现的[21]。Filipczak-Bryniarska等[22]的研究比较了吗啡、丁丙诺菲、羟考酮对健康小鼠皮肤超敏反应的影响，表明羟考酮几乎不影响皮肤超敏反应；而体外研究[23]的结果表明，羟考酮会抑制IL-6等炎性细胞因子分泌。上述研究结果与本研究结果均提示，羟考酮对于机体免疫系统的抑制作用较小。

羟考酮注射液在欧美国家广泛应用，但在中国于2013年底才上市。羟考酮因其具有内脏镇痛的优势，在结肠癌术后镇痛中的使用越来越普遍。与羟考酮相关的免疫调节方面的研究比较缺乏。有研究[24]发现，羟考酮的C6被羰基取代，并且C7～8存在单键结构，这种结构在促进其镇痛作用的同时减少免疫抑制。此外，阿片类药物通过直接作用于μ型阿片受体3激活细胞膜上与阿片受体耦联的钙离子通道，导致细胞内钙增加，激活下游信号通路，增加NF-κB抑制蛋白a(iKBa)的转录和稳定性，抑制NF-κB与细胞核内特定DNA启动基因结合，从而抑制T淋巴细胞和Th1细胞因子IL-2、IFN的表达[25]。因此，从羟考酮与μ受体的亲和力推测其免疫抑制较小，但其相关机制还需要进一步研究。

本研究中，外周血中淋巴细胞比例与脾脏中并不一致。在外周血中，对照组的淋巴细胞比例与羟考酮组接近，并且两组的CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+Th细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞所占比例均高于舒芬太尼组和芬太尼组。在脾脏中，羟考酮组的淋巴细胞比例与舒芬太尼组接近，并且两者的CD3+T淋巴细胞、CD3+CD4+Th细胞和CD3+CD8+T淋巴细胞所占比例均高于对照组和芬太尼组。脾脏是外周发生免疫应答的主要场所，具有大量树突状细胞，而相关研究[26-27]结果表明舒芬太尼能够促进脐树突状细胞发育成熟。由此推测，给予舒芬太尼后，通过促进树突状细胞提呈肿瘤抗原，活化增殖脾脏中的抗肿瘤免疫细胞。而NK细胞是天然的免疫细胞，无需抗原提呈细胞的辅助，因此可以解释脾脏中的NK细胞比例与外周血中的趋势相同。有研究[28]发现，大剂量的芬太尼通过抑制外周的NK细胞杀伤功能(NKCC)促进肿瘤的肺转移和提高癌细胞的存活率，与本研究结果相似。不同的免疫区间接触的抗原类型和数量不同，免疫细胞的组成和结构、所属的神经支配、内分泌作用也不同，因此即使在相同的药物作用下，在不同的免疫区间也可能出现不同的结果。

血浆细胞因子主要由免疫细胞分泌。成熟的Th细胞进一步功能分化为Th1和Th2等类型的细胞。正常机体的Th1/Th2处于平衡状态，肿瘤患者的Th1/Th2偏移与不良的预后相关。Greeneltch等[29]的研究发现，Th1/Th2比值较低的结肠癌患者术后总体生存时间仅(35.5±5.0)个月，而Th1/Th2比值较高的患者为83.5个月，因此偏Th2的免疫类型更不利于结肠癌患者的康复。本研究在检测前只给予小鼠阿片类药物，并未予其他刺激，因此主要反映的是肿瘤小鼠的基础免疫功能，通过检测发现芬太尼组中血清Th1/Th2比值<1，反应偏Th2型免疫。之前也有研究结果表明，吗啡抑制Th1型细胞因子IFN-γ[30]，促进体外[31]和体内[32]IL-4产生，通过Fas/Fas配体依赖性激活诱导的Th1细胞死亡[33]。肿瘤的抗免疫功能主要依靠Th1型免疫细胞占优势的免疫状态，Th2偏移型的免疫细胞促进肿瘤进展[34-35]。本研究结果显示，芬太尼组Th1/Th2比值<1，说明Th2型的免疫细胞占优势，可能是促进肿瘤进展的因素之一，间接表明芬太尼与其他两种阿片类药物相比，更不适合用于肿瘤机体。

综上所述，羟考酮对种植结肠癌细胞株的小鼠的免疫功能抑制最小。与舒芬太尼、芬太尼相比，羟考酮可能是避免肿瘤手术后肿瘤复发和转移更安全的阿片类药物。