水产发酵制品中生物胺的研究进展

赵婉，王艳峰，史振平, *，解万翠, *，葛晓萍，罗钦

1. 青岛科技大学海洋科学与生物工程学院（青岛 266042）；2. 山东省生物化学工程重点实验室（青岛 266042）

水产品中的高值产品经简单处理后直接进入市场，高值产品的生产加工过程中会产生大量的下脚料，如鱼头、鱼皮、鱼鳍、鱼尾、鱼骨、鱼内脏、虾头、虾壳、蟹壳、贝类及残留肉，其质量占原料的40%～55%。另外，在捕获或养殖所得的水产品中还包括一些未经处理的低值水产品如小鱼小虾。这些低值水产品和水产品加工下脚料如果被直接丢弃，不仅资源浪费，而且会污染环境。而这些副产品中不仅含有大量的蛋白质，且含有丰富的磷脂、矿物质及甲壳素等其他生物活性物质[1]。以低值水产品和高值水产品下脚料发酵而成的产品称为水产发酵制品，如海鲜酱油、鱼露、鱼酱、鱼子酱、虾酱、蟹酱等因其含有丰富的营养物质以及独特的海鲜风味而成为我国沿海和东南亚地区常用的调味料。水产品发酵过程中，微生物发挥至关重要的作用。与此同时进行的另一过程是水产品的腐败。水产品在捕获时体内已经存在多种微生物，这些微生物来自原料本身或与水产品生长相关的环境[2]。水产品中一般都富含易降解蛋白质，这些蛋白质易被微生物降解产生游离氨基酸，具有氨基酸脱羧酶活性的微生物使游离氨基酸脱羧后生成相应的生物胺（Biogenic amine，BAs）。高含量生物胺对人体的危害极大。且此问题尚未引起相关部门和行业的足够重视。课题组长期从事虾酱中的风味物质、发酵过程中的微生物及生物胺的去除研究，在前期研究的过程中积累了有关水产发酵制品生物胺的相关理论知识，通过对水产发酵制品中生物胺的存在、产生、检测及控制理论的阐述，能够加深对该领域的理解，并为后续的相关研究提供基础。

1 水产发酵制品中的生物胺

生物胺是一类具有生物学活性、含氨基的低分子量有机化合物的总称。根据其结构分为三类：脂肪族生物胺如腐胺、尸胺、精胺和亚精胺；芳香族生物胺如酪胺和苯乙胺；杂环生物胺如组胺和色胺。一般来说，新鲜水产品中生物胺含量很低；而在储存或加工过程中，它们的浓度会受到影响[3]。目前研究显示发酵水产品中的生物胺主要包括组胺、色胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、亚精胺、酪胺和精胺8类，组胺和酪胺的含量显著高于其他种类的生物胺[4]。课题组利用新鲜虾头在实验室条件的发酵产物中检测发组胺的含量高达120.7 mg/kg。人体内存在微量的内源性生物胺，且对机体的生理活动具有重要意义，在参与免疫反应和炎症反应[5]、调节DNA、RNA和蛋白质合成[6]、调节血压和血糖浓度以及抗氧化方面[7]均显示了重要作用。但当摄入大量外源性生物胺时会对人体产生毒理效应，如头痛、心悸、水肿、呕吐、腹泻等，甚至危及生命[8]。生物胺除了自身产生毒性以外，某些生物胺可与亚硝酸盐反应生成致癌物亚硝胺、亚硝基吡咯烷、亚硝基哌啶等[9]。目前，国际上对食品中生物胺的安全限量尚未有统一的标准，各个国家或组织根据各自的法律和食品状况对不同食品中生物胺的含量做出规定。但到目前为止，我国GB 10133—2014《食品安全国家标准 水产调味品》中尚无关于生物胺的具体限量要求。

在水产品发酵过程产生的各种生物胺中，组胺对人类健康的影响最大[10]。组胺通过与细胞膜上的两类受体作用而发挥毒性：通常会导致轻微的疾病与各种各样的症状，包括皮疹、荨麻疹、恶心、呕吐、腹泻、潮红、刺痛、皮肤发痒。症状的严重程度可能与组胺摄入量和个人对组胺的敏感性有很大的不同[11]。酪胺可促进末梢血管收缩，刺激心律加快，增强呼吸作用，增加血糖浓度，消除神经系统中的去甲肾上腺素，引发偏头疼；酪胺还是动物体内的主要致突变前体物质[12]。腐胺和尸胺对人类没有任何不良的直接健康威胁，而是通过抑制组胺代谢酶如单胺或二胺氧化酶和组胺甲基转移酶的活性增强组织胺和酪胺的毒性效应。另外，食品中的腐胺和尸胺与亚硝酸反应形成杂环致癌的亚硝胺，后者是人类已知的最强致癌剂[13]。其他生物胺如精胺、亚精胺、可能与亚硝酸盐反应形成致癌的亚硝胺、苯乙胺也可增强组胺毒性[14]。

2 水产发酵制品中生物胺的产生

虽然外源生物胺的产生方式有氨基酸脱羧作用和酮或醛类物质的胺化或转胺作用两条途径，在发酵水产品中生物胺主要是通过微生物脱羧酶催化氨基酸的脱羧而生成的[15]。所以在水产品发酵过程中，游离氨基酸、具有氨基酸脱羧酶活性的微生物以及微生物适宜生长的环境对生物胺的产生和积累影响显著。因此水产发酵制品中生物胺的种类和含量主要取决于水产品原料中自身所含氨基酸的组成，例如青皮红肉类鱼金枪鱼、鲭鱼和鲐鱼等鲭科鱼类由于含有丰富组氨酸容易产生组胺，因此组胺中毒又叫鲭科鱼类中毒。而白肉类鱼中腐胺和尸胺含量较高。

除某些水产品原料中天然带有少量生物胺外，水产品发酵过程中生物胺的形成以氨基酸脱羧为主。且上述途径需满足要3个条件：充足的组胺前体物质氨基酸、具有氨基酸脱羧酶活性的微生物以及用于组氨酸与生物胺胺在细胞内外输送的转运蛋白。发酵水产品中生物胺的合成过程大致如下：游离氨基酸经转运蛋白从细胞外运送至细胞内后，由氨基酸脱羧酶催化脱去羧基，生成相应的生物胺，生成的生物胺再由转运蛋白输送到细胞外。生物胺胺的前体物质是游离氨基酸，富含游离氨基酸的水产品原料在发酵过程中特别容易产生和积累生物胺。生物胺合成过程中的另一个重要参与者是位于细胞膜内的逆向转运蛋白，其负责将氨基酸运输到胞内，并将脱羧后的产物生物胺分泌到胞外。研究发现在组胺产生过程中由转运蛋白参与的摄取底物和分泌产物是一个偶联的过程，即氨基酸由胞外进入到胞内和相应的生物胺分泌到胞内是同时进行的[16]。在酪氨酸的脱羧途径中，转运蛋白可同时促进酪氨酸-酪氨酸和酪氨酸-酪胺的交换[17]。具有氨基酸脱羧活性的微生物在组胺产生过程中发挥至关重要的作用，因为生物胺生成途径的关键酶氨基酸脱羧酶是由生物胺产生菌合成分泌的。根据目前的报道具有产生物胺能力的微生物主要有：肠杆菌科（Enterobacteri aceae）、乳杆菌属（Lactobacilli）、假单胞菌属（Pseudomonads）以及肠球菌（Enterococci）等[18]。组氨酸脱羧酶（Histidine decarboxylase，HDC）可以分为两类，分别以磷酸吡哆醛和共价的丙酮酰为辅基[19]。而目前仅发现以磷酸吡哆醛为辅因子的酪氨酸脱羧酶。

3 水产发酵制品中生物胺的检测

鉴于目前政府和公众对食品安全的高度关注，发展先进的检测方法对发酵水产品中生物胺进行检测，及时发现食品中的不安全因素，是保障消费者健康的重要前提之一。因此，可靠、快速和准确的生物胺检测方法非常重要。

生物胺检测手段最常用的方法为高效液相色谱（HPLC），该方法快速、灵敏、重现性好，但是复杂耗时、仪器昂贵、不便携[20]。其他的检测方法包括薄层色谱、气相色谱法以及酶联免疫法（ELISA）。上述方法均有效，但是也有各自的缺点，如费时、敏感性低，而且不适合常规检测。企业一般采用免疫试剂盒区分组胺含量大于或小于50 mg/L的海产品，该方法只是定性方法，不能定量[21]。毛细管电泳作为一种高效分离分析技术，是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，通过样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现的一类液相分离技术，因其进样量小、分离模式多、分析对象广等优点，已被广泛应用于各个领域；电化学发光分析法不用外加光源，因具有较低的背景信号而使被分析物的检出限低，线性范围宽，可获得较高的灵敏[22]。因此，有研究者将这两种方法结合一起，可以达到高效、快速、样品消耗少、操作简单、成本低的效果。生物胺没有天然的吸收和荧光，但是使用联吡啶钌[Ru(bpy)32+]可以产生电化学发光。而且有多种措施可以提高电化学发光的灵敏度。国内已有数个课题组利用毛细管电泳-电化学发光法测定不同水产品中生物胺类的报道，如：青蛾、花蛤、海瓜子中组胺和亚精胺的测定[23]；鱼露中苯乙胺的测定[24]；鲳鱼中的色胺[25]。除此之外，分子生物学的发展使得以PCR技术为基础的方法用于生物胺的检测成为可能。基于微生物中氨基酸脱羧酶基因的保守性而设计引物，根据扩增片段的结果判定待测样品中是否含有某种氨基酸脱羧酶，从而推测生物胺产生菌的存在与否。如使用多重PCR同时检测多种脱羧酶基因[26]。

4 水产发酵制品中生物胺的控制

随着公众和国家对食品安全的重视程度和要求越来越高，如何有效控制发酵水产品中的生物胺迫在眉睫。从源头上来看，发酵水产品中生物胺产生的主要影响因素包括食品原材料的状况、微生物的污染以及贮藏条件；在这些因素中，微生物的作用是最主要的。目前，为了预防生物胺胺的产生和积累，研究了各种方法如调整贮藏条件、辐照、高静水压、食品添加剂和防腐剂，以及负胺发酵剂的使用等。上述方法主要通过抑制生物胺产生菌的生长以达到抑制生物胺产生的目的，如降低温度可以有效抑制生物胺产生菌的生长和繁殖；这些方法能够在一定程度上降低生物胺的含量，但也存在局限性，如有些微生物在低温下也能产生生物胺。辐照也是一种有效的降解组胺分子的方法，但其主要缺点是产生自由基化合物的潜在健康危害[27]。而且上述方法均不能消除已经产生的生物胺。一旦生物胺在食品中累积，很难避免中毒，因为其结构对热和低温非常稳定[28]。如何清除发酵过程中已经产生的生物胺成为研究者关注的另一热点问题。

研究表明，水产品中除了含有合成并分泌生物胺脱羧酶从而生成生物胺的微生物之外，还含有能产生某种生物胺氧化酶或生物胺脱氢酶等酶类，从而能降解食品中的生物胺的微生物[29]。Renata等[30]对各种发酵食品中菌株的生物胺代谢过程进行研究，证实食品发酵过程中产生物胺的菌株并不具备降解生物胺的能力。据此，水产品中生物胺的消长应是由不同微生物引起的。前期在多种发酵食品中研究结果认为，在食品发酵初期，原材料中游离氨基酸在细菌氨基酸脱羧酶的作用下，分解成生物胺。而随着发酵的进行，盐分逐渐渗入机体，并分布均匀，逐渐升高的盐浓度和原材料自身pH的变化，抑制了生物胺产生菌的生长，而生物胺分解酶的细菌却增加，从而使得生物胺含量降低。随着生物胺分解酶的细菌的生长，两种细菌达到了一种平衡，生物胺含量趋于稳定[29]。课题组前期的研究表明在发酵过程中虾酱中组胺含量的变化规律是：短期内（0～2 d）组胺含量快速上升，随之组胺含量增速放缓（2～4 d），之后一直到发酵成熟，虾酱组胺含量达到最高值[31]。在此理论指导之下，首先从腌制水产品中分离到1株产组胺氧化酶的嗜盐古细菌（Natrinema gari BCC 24369）[32]；之后陆续在香肠、奶酪、葡萄酒、鱼露等各种发酵食品中分离到具有降解组胺能力的微生物菌株。国内多位学者分别从鱼露、鲭鱼、咸鱼中分离到生物胺降解菌进行过研究[33-36]。对组胺降解酶的进一步研究表明，组胺氧化酶在水和氧的存在下可将组胺转化成咪唑乙醛、氨和过氧化氢[37]。组胺脱氢酶使组胺脱氨生成乙醛和氨，但不生成过氧化氢[4]。但是组胺脱氢酶去除组胺的效果并不理想[38]。而且，相对于分离获得的众多产生组胺氧化酶的菌株，组胺脱氢酶及组胺脱氢酶产生菌株的分离研究也较少。因此，绝大多数的研究集中于组胺氧化酶及产生菌株。除了从食品基质中分离获得的菌株之外，也有学者将具有组胺氧化酶活性的已有菌株作为发酵剂添加到食品中，如亚麻短杆菌（Brevibacterium linens）可减少奶酪中组胺含量[39]；沙克乳杆菌（Lactobacillus sakei）[40]、金黄色葡萄球菌FS19和解淀粉芽孢杆菌[41]、木糖葡萄糖球菌（Staphylococcus xylosus）[42]也使鱼露中组胺含量减少；香肠乳杆菌（Lactobacillus farciminis）可降解红酒中的组胺[43]。因此，在发酵水产品中可利用微生物的生物胺降解酶来降低其中生物胺的含量，该方法可以消除已经生成的生物胺，而且利用微生物来控制水产品中的生物胺含量，具有生物反应的一般优点，如作用条件温和、反应迅速、安全可靠、节约能源等。

5 结语

由于水产发酵制品所拥有的庞大的消费人群和广阔的市场前景，水产发酵制品的安全性一直受到研究者的关注。生物胺对水产发酵制品的安全性影响极大，因此了解水产品发酵过程中生物胺的产生、含量的检测从而最终高效安全消除生物胺的研究具有重要意义。前期的研究已经对该过程取得了长足的进展，然而其中也有许多未解之谜，例如水产品发酵过程中与生物胺含量相关的微生物菌落结构如何发生变化，或者说微生物的群落结构变化如何影响生物胺的含量变化？生物胺产生菌和降解菌之间的此消彼长如何调控？随着后续研究的进行，水产品发酵过程生物胺的生成、累积与消减机制将逐步被揭示。