蛋黄主要蛋白质研究进展

谢云霄，耿放，王金秋*

农业部杂粮加工重点实验室，成都大学药学与生物工程学院（成都 610106）

蛋黄蛋白质因其优良的营养特性、多样的功能特性和生物活性，一直是食品蛋白质研究的重要对象。蛋黄中的蛋白质主要包括卵黄免疫球蛋白（Immunoglobulin Y，IgY）、蛋黄低密度脂蛋白（Egg yolk low density lipoprotein，EY-LDL）、蛋黄高密度脂蛋白（Egg yolk high density lipoprotein，EY-HDL）以及卵黄高磷蛋白（Phosvitin，Pv）等。就蛋黄主要蛋白质的研究进展进行综述，为蛋黄蛋白质的深入研究和功能性高值化新型蛋制品的开发提供参考。

1 蛋黄蛋白质的合成与转运

与蛋清蛋白质主要在输卵管中合成不同，蛋黄蛋白质的前体主要由母鸡的肝脏合成并分泌到血液中，通过血液循环达到卵巢、转移到卵母细胞中，再经过酶解和重新组合，形成蛋黄中的卵黄颗粒（Yolk granule）和浆质（Yolk plasma）。

1.1 载脂蛋白（Apolipoprotein B）与蛋黄低密度脂蛋白

鸡蛋黄低密度脂蛋白（EY-LDL）存在于卵黄浆质中，约占蛋黄干重的65%。EY-LDL是一种脂蛋白复合体，其脂质部分约占90%，主要为甘油三脂和胆固醇，其由母鸡血液中的极低密度脂蛋白（VLDL）转化而来。VLDL在母鸡的肝脏中合成，随血液运输通过卵母细胞膜上的受体介导和吞噬进入卵母细胞（蛋黄）。研究表明，EY-LDL的蛋白质部分的前体主要为载脂蛋白B（Apolipoprotein B，APOB）[1]。APOB由4 631个氨基酸组成，其翻译后被裂解为7个片段（Apovitellenin 1～7），这些蛋白质片段与磷脂、甘油三脂和胆固醇组合，共同构成了EY-LDL。

1.2 卵黄蛋白原（Vitellogenins）与蛋黄高密度脂蛋白和卵黄高磷蛋白

蛋黄高密度脂蛋白（EY-HDL）含量约占蛋黄蛋白质的16%，卵黄高磷蛋白的含量约占蛋黄蛋白质的4%，它们都来源于卵黄蛋白原（Vitellogenins）。卵黄蛋白原在母鸡肝脏中合成并分泌到血液中，经血液循环转运到卵巢后，在受体介导下通过内吞作用进入卵母细胞。转运到蛋黄中的卵黄蛋白原主要有三种，Vitellogenin 1～3，它们序列差异较大，但具有相同的结构域。随后，卵黄蛋白原发生裂解，产生Lipovitellin-1、Lipovitellin-2、卵黄高磷蛋白和卵黄糖蛋白（Yolk glycoproteins，YGPs）[2]。其中，Lipovitellin-1、Lipovitellin-2与磷脂结合，组装成为EY-HDL复合体，而YGPs则进入到卵黄浆质部分。EY-HDL与卵黄高磷蛋白、少量的EY-LDL进一步组装形成卵黄颗粒。

1.3 卵黄免疫球蛋白

卵黄免疫球蛋白（IgY）主要存在于卵黄浆质中，约占蛋黄总蛋白质的10%。IgY是由母鸡血清中的免疫球蛋白在特异性受体介导下从血液转移到卵母细胞中。在胚胎发育过程中，蛋黄中的IgY再次由受体介导转移到胚胎血液中，为胚胎发育提供被动免疫[3-4]。

2 蛋黄蛋白质在蛋黄中的组织状态

在天然条件下，蛋黄由连续的水相（卵黄浆质）和大小在0.3～2 μm范围内的不溶性颗粒组成[5]，而EY-LDL以胶体颗粒的形式（17～60 nm）分散在卵黄浆质中。卵黄颗粒的组成为：70%的EY-HDL、10%的Pv和12%的EY-LDL。EY-HDL是一个类似球状的假分子结构，通过磷酸钙桥与Pv相结合，形成复杂的卵黄颗粒结构，其间含有嵌入式的EY-LDL囊泡。有研究发现，卵黄颗粒中掺入的EY-LDL是电荷和空间位阻作用的结果，其可使卵黄颗粒整体结构更为紧密和平滑，降低整体空间阻力[6]。卵黄浆质部分的组成为：约85%的EY-LDL和15%的球状蛋白，主要为血清蛋白（Serum Albumin，又被称为α-livetin）、IgY（γ-livetin）和卵黄糖蛋白（YGP42/YGP40/YGP30等，亦被称为β-livetin）[7]。

3 鸡蛋黄蛋白质的结构与功能

3.1 IgY的结构与功能

IgY由4个亚基组成，包括两条重链和两条轻链。重链包含1个可变域和4个恒定域，轻链由1个可变域和1个恒定域组成。由质谱分析得出IgY的分子质量为167 250 Da，其中重链的分子质量为65 105 Da，轻链的分子质量为18 660 Da。IgY可分为2个抗原结合片段（Fab）和1个可结晶片段（Fc），其中Fc部分是大多数生物功能作用的位点[8]。

用抗原刺激产蛋母鸡的免疫系统，即可表达和分泌特异性的抗体，并转移至蛋黄中，从而获得特异性IgY。特异性IgY与病原体结合，可阻滞病原体的繁殖、加速病原体的清除，因此在免疫治疗方面具有广阔的应用前景。在畜禽养殖中，特异性IgY可抵御病原微生物的侵染、繁殖，起到预防和治疗流行性疾病、促进畜禽幼仔生长发育、增强免疫力的作用[9]。喂食了特异性IgY的雏鸡，其对球虫病的抵抗力显著增强，且减少了盲肠损伤和卵囊脱落，同时增强了雏鸡体重[10]。在仔猪饲养中，特异性的抗病毒IgY（猪传染胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒）具有很好的应用效果，能够快速抑制病毒的复制，并显著降低仔猪病死率[8]。特异性IgY亦可用于人类病原传染病的防治，如抗轮状病毒IgY用于治疗小儿轮状病毒肠炎，可加快病毒清除、改善临床体征并缩短病程[11]。

此外，IgY具有很强的特异性和灵敏度，因此在免疫检测和诊断上得到了广泛的应用。利用免疫母鸡制备抗血吸虫虫卵特异性IgY，并将其作为捕捉抗体用于ELISA检测，可有效检出人尿液中的血吸虫可溶性虫卵抗原[12]。王云芸等[13]研究建立了基于特异性IgY的ELISA检测体系，对引起腹泻的诺如病毒进行检测，结果显示出良好的特异性。基于特异性IgY建立的食品中庆大霉素ic-ELISA检测方法，其对庆大霉素具有很好的检出效果，该方法具有推广到其他抗生素残留检测的潜力[14]。

3.2 EY-LDL的结构与功能

研究表明，EY-LDL为球形纳米颗粒（17～60 nm），磷脂、蛋白质和少量胆固醇形成外层膜状结构，包围着由甘油三酯和胆固醇组成的脂质核心。在外层膜结构中，磷脂和蛋白质提供两亲特性，对EYLDL的结构稳定性起着重要作用，而外层膜中镶嵌的少量胆固醇分子，则增加了磷脂的刚性[7]。采用原子显微镜观察EY-LDL，发现在溶液体系中，EY-LDL的浓度较低时，LDL呈单个分子的分散状态，其尺寸一般在50～80 nm之间；且随着浓度的增加，EY-LDL开始聚集，形成聚合物，成像尺寸增大[15]。

新鲜蛋黄是由约50%的水、30%～35%的脂质和15%～18%蛋白质组成的稳定乳液体系。EY-LDL分子自身的水包油型乳化纳米颗粒结构，被认为是蛋黄乳液体系保持稳定的重要原因[16]。EY-LDL在油水界面吸附时，会发生破裂，释放出中性脂质、磷脂、载脂蛋白，中性脂质聚集形成油滴，而磷脂、载脂蛋白则吸附在界面上，形成较为稳定的界面膜[7]。而在气液界面上，EY-LDL破裂后，其中性脂质、载脂蛋白和磷脂组分均参与形成界面膜[17]。EY-LDL稳定的乳化纳米分子结构，是构建新型食品纳米乳化体系的绝佳参考模型，需要更为深入和系统的研究。

除了乳化稳定特性，EY-LDL还具有良好的凝胶特性，对蛋黄及其制品的加工和产品的质构特性具有重要影响[18]。研究显示，EY-LDL水溶液（4%）在70℃时开始发生变性，并在75 ℃下形成热凝胶。在加热过程中，EY-LDL分子中的蛋白质部分发生变性解和去折叠，内部官能团暴露并通过疏水作用、交联作用等发生重排，从而形成凝胶[7]。此外，EY-LDL在冷冻时亦会发生凝胶化，利用该特性，将其应用于动物精液（公牛、公羊、马）的冷冻保存，可显著提高精子的存活率和人工受精的成功率，对家畜的繁育具有重要作用[18]。

3.3 EY-HDL的结构与功能

EY-HDL是一个分子量约400 kDa的球状分子，其蛋白质部分由4个亚基组成，分别为2个Lipovitellin-1（约125 kDa）和2个Lipovitellin-2（约25 kDa）；脂质占总分子量的25%左右，以磷脂为主。EY-HDL的蛋白质部分通过折叠，形成一个疏水性的漏斗形空腔，磷脂分子先与空腔表面的疏水性氨基酸吸附，而后甘油三酯再吸附于磷脂分子形成的新的疏水空腔中[19-20]。

在鸡胚发育过程中，EY-HDL不仅分解自身为胚胎发育提供营养物质，还可以转运微量元素和脂质，从而促进胚胎的生长。研究显示，EY-HDL参与锌离子的转运，从而降低鸡胚发育过程中的畸变[21]。EYHDL对肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌以及大肠杆菌均有一定的抑制作用，可以抵御病菌入侵保护胚胎[22]。与血清HDL功能相似，EY-HDL也可清除血管内壁沉积的胆固醇，具有潜在的预防动脉粥样硬化的作用[2]。此外，EY-HDL水解后产生的多肽具有一定的抗氧化活性，是食品源功能性多肽的潜在来源[23]。

3.4 Pv的结构与功能

Pv是已知蛋白质中磷酸化程度最高的蛋白之一，在其217个氨基酸残基中，丝氨酸（Ser）残基为123个，占比高达56.7%，并且绝大部分丝氨酸都发生了磷酸化修饰。高度磷酸化的Pv分子整体呈无规则卷曲的线状结构，在其N-末端和C-末端为小的疏水区域，连续的磷酸化丝氨酸片段分布于分子中部，形成了两端疏水、中间亲水的两亲性结构[24]。

由于高度的磷酸化修饰，Pv在水溶液中为典型的酸性蛋白质，易与各种阳离子（如Fe3+、Fe2+、Ca2+、Mg2+等）相结合，如蛋黄中95%的铁离子都是以与Pv结合的形式存在的。由于铁离子是微生物生长必须元素，亦是氧化反应的重要催化剂，因此与铁离子的高结合力，使Pv具有一定的抑菌作用和抗氧化活性。此外，Pv与钙离子相互作用形成的磷酸钙桥，是Pv与EY-HDL结合形成卵黄颗粒的最为重要的作用力。

两端疏水、中间亲水的分子结构，使Pv具有良好的乳化性，其分子内大量的磷酸根提供高负电荷和静电斥力，维持了油水界面的稳定性，抑制了乳化液的絮凝和聚集。常见的食品添加剂（如甘油、果胶、海藻糖等）可适当增加Pv的疏水性，共同使用时具有协同增效作用。同时Pv糖基化作用，可提高Pv的乳化稳定性和对极端pH环境的抗性，Pv疏水末端脂肪酸（FA）的引入是改善Pv加工特性的另一种有效手段[25]。此外，金属离子对Pv的乳化特性具有一定影响，在乳化液形成之前添加铁离子，Pv的乳化性能变弱，但抗絮凝的能力变强[26]。热处理对Pv的乳化性具有负面的影响，当热处理温度高于65 ℃时，其乳化能力开始下降，而高于70 ℃时，乳化稳定性也开始下降[27]。

Pv水解后产生的磷酸肽（PPPs），具有多种生物活性。PPPs中的磷酸化丝氨酸残基能够与钙离子结合形成可溶性络合物，从而抑制钙离子形成不溶性的盐，避免钙的流失并促进肠内钙的吸收[28]。徐彩娜等[29]研究表明，PPPs具有清除DPPH自由基、抗氧化能力，可降低细胞的氧化应激反应。

4 鸡蛋黄蛋白质的分离纯化

在蛋黄蛋白质的分离纯化过程中，一般先将蛋黄稀释后离心，分别获得卵黄浆质（上层溶液）和卵黄颗粒（下层沉淀）部分。为了达到较好的分离效果，该步骤中蛋黄的稀释倍数通常为1～5倍，同时可添加适当浓度的盐（＜0.3 mol/L），以提高分离效率。

4.1 卵黄浆质蛋白质的分离纯化

IgY为水溶性蛋黄蛋白质，溶解于卵黄浆质中，因此，在分离获得卵黄浆质部分后，需将其与EYLDL分开。目前常用的方法为硫酸铵沉淀法或者多聚物沉淀法，操作简单、条件温和，对IgY的活性影响较小。在此过程中，聚乙二醇或高分子多糖等多聚物的使用，可以促进EY-LDL的沉淀与析出，从而提高分离效率[30]。经过分离获得的IgY纯度一般可达到81%，如需进一步纯化，可采用阴离子交换层析法，最终可使IgY的纯度达到95%以上[30]。

在获得卵黄浆质之后，若以EY-LDL为目标蛋白，则可通过硫酸铵沉淀法或聚乙二醇沉淀法对浆质中的EY-LDL进行进一步分离。Wang等[31]对比了上述两种方法，结果显示，用硫酸铵沉淀法分离提取EYLDL时，硫酸铵饱和度为30%时的效果最佳，EY-LDL的得率较高且杂蛋白含量少；聚乙二醇沉淀法中，在PEG分子量为4 000、浓度为5%、卵黄浆质溶液的pH为6的条件下，分离效果最佳。两种方法对比，PEG沉淀法提取得到的粗提LDL干物质含油率和蛋白质提取率分别为68.14 g/100 g干物质和69.91%，硫酸铵沉淀法得到的粗提LDL干物质含油率和蛋白质提取率分别为57.72 g/100 g干物质和69.41%，前者效果要优于后者。若需要获得更高纯度的EY-LDL，可基于EYLDL分子量较大的特点，通过凝胶过滤层析法进一步除去杂蛋白。

4.2 卵黄颗粒蛋白的分离纯化

卵黄颗粒中的主要蛋白质为EY-HDL和Pv，这两种蛋白质通过磷酸钙桥紧密结合，若要分别获得EYHDL和Pv，首先需对卵黄颗粒进行处理，打开磷酸钙桥。目前常用较高的离子强度打开磷酸钙桥，如Zhang等[32]将卵黄颗粒与9倍质量的高盐溶液（100 g/L氯化钠）混合，搅拌使卵黄颗粒解聚，随后向溶液中加入4%的聚乙二醇并调整溶液pH为4.5，此时在聚乙二醇作用下，EY-HDL聚集发生沉淀。从而与Pv分开。如需进一步的纯化，可采用阴离子交换层析等方法[24]。

5 结语与展望

当前，对于蛋黄蛋白质的结构、功能和特性已经有了较为丰富和深入的研究，为蛋黄蛋白质的应用提供了基础。但是，蛋黄及蛋黄蛋白质仍有诸多未知领域，如蛋黄蛋白质的翻译后修饰结构、EY-LDL分子及卵黄颗粒超分子的组装机制、蛋黄自身（水、脂质、蛋白质多相体系）的稳定机制等。未来，针对这些科学问题的深入探索，将进一步加深对蛋黄蛋白质的认识，促进蛋黄及蛋黄蛋白质的开发和应用。