HPLC法测定安胎饮合剂中黄芩苷的含量

邹福贤 ，李 鸷 ，李 宇 ，李 丹 ，许 文 ，徐 伟 ，褚克丹

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福州市中医院，福建 福州 350001）

安胎饮合剂为福州市中医院的院内制剂，在临床上用于治疗脾肾两虚、气血不足引起的胎漏、胎动不安（先兆流产）等症状，疗效可靠显著。本方由党参、菟丝子、黄芩等多味中药组成，具有补肾健脾、固任安胎之功效，方中黄芩为清热燥湿安胎之王，用于治疗胎动不安［1］。

黄芩苷是《中华人民共和国药典（一部）》（2015年版）中黄芩的含量测定指标性成分［2］，现代药理学研究表明其具有治疗心血管疾病、抗过敏、抗氧化、增强免疫力等作用［3-8］，是安胎饮中的重要活性成分。本研究选取安胎饮合剂中黄芩的黄芩苷成分作为指标性成分，建立高效液相色谱法，对安胎饮合剂中的黄芩苷进行定量分析，为建立安胎饮合剂的质量评价体系提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1290型超高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；CPA225D型十万分之一分析天平（德国Sartorius公司）；KQ-500DE台式超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药 安胎饮合剂（批号：20180315、20180322、20180329）；黄芩苷（中国食品药品检定研究院，批号：110715-201720）；乙腈、甲酸为色谱纯，超纯水（美国 Millipore公司），其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Welch Ultimate XB-C18（5μm，250×4.6 mm），以乙腈∶0.1%甲酸水溶液＝30∶70（V／V）为流动相，柱温为 30℃，检测波长为 280 nm，流速为1.0 mL·min-1，进样量为10μL。在此色谱条件下，基线平稳，黄芩苷分离度大于1.5，理论塔板数按黄芩苷计均大于5 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品4.84 mg，置5 mL量瓶中，加适量甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得含有0.968 mg·mL-1黄芩苷的对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取安胎饮合剂约1.0 g，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理 30 min（功率 250 W，频率 50 kHz），放冷；再次称重，50%甲醇补足减失重，摇匀，离心；再0.22μm滤膜滤过，取续滤液用50%甲醇稀释10倍，得供试品溶液。

2.3 专属性实验 按照安胎饮合剂处方比例制备缺黄芩的阴性样品，按供试品溶液制备方法，同法制备相应的阴性样品溶液。分别取对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行色谱分析。结果供试品溶液色谱中，与对照品相同保留时间处有色谱峰，而阴性样品溶液在相同保留时间处无色谱峰干扰，说明本方法专属性良好，各色谱图见图1。

图1 样品色谱图

2.4 线性关系考察 按照“2.1”项下色谱条件，取“2.2.1”项下对照品储备液，分别配制成含有黄芩苷0.484、0.968、2.420、4.840、9.680、19.360、29.040 μg／mL的对照品溶液，进样10μL，测定峰面积。以黄芩苷的浓度为横坐标（X），以黄芩苷色谱峰峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得黄芩苷线性回归方程：

表明黄芩苷在0.484～29.040μg·mL-1浓度范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系，见图2。

2.5 中间精密度试验 取同一批安胎饮合剂 （批号20180315），按 “2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在同一个实验室，经过不同时间和3个不同分析人员按“2.1”项下测定黄芩苷的含量。结果不同时间检测的黄芩苷含量RSD为0.90%，不同操作人员检测的黄芩苷含量RSD为0.9%。结果表明实验方法具有较好的精密度。

图2 黄芩苷标准曲线

2.6 重复性试验 精密称取同一批安胎饮合剂（批号20180315）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，带入标准曲线计算黄芩苷的含量，其平均含量为2.94 mg／g，RSD为1.0%，结果表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验 取批号为20180315的安胎饮合剂，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12 和 24 h 按“2.1”项下测定黄芩苷的峰面积，结果RSD为0.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 回收率试验 取9份重复性实验同批安胎饮合剂，每份0.50 g，分为低、中、高3组，每组3份，分别为低-1、低-2、低-3、中-1、中-2、中-3、高-1、高-2、高-3，低组添加相当于样品中黄芩苷含量的50%，中组添加相当于样品中黄芩苷含量的100%，高组添加相当于样品中黄芩苷含量的150%，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，计算黄芩苷的回收率和RSD，结果见表1。加样回收率在96.09%～106.1%，RSD小于3.0%。表明该方法回收率良好。

2.9 耐用性试验 取同一批安胎饮合剂（批号20180315）3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。在不同柱温25、30和35℃下，按“2.1”项下测定各成分的含量，结果无明显差别；在不同流速调0.8、1.0 和 1.2 mL·min-1下，按“2.1”项下测定各成分的含量，结果无明显差别；分别采用Ultimate XB-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）、DiamonsiL C18 （2）（5 μm，250×4.6 mm）和XSELECT CSH C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）3种不同色谱柱，按“2.1”项下测定各成分的含量，结果无明显差别。上述各个条件下检测出黄芩苷含量的RSD为0.5%。

2.10 含量测定 取不同批次安胎饮样品各3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下测定各成分的峰面积，计算安胎饮合剂中黄芩苷成分的含量，见表2。

表1 加样回收率实验结果（n＝9）

表2 样品含量测定结果

3 讨 论

本研究前期对供试品溶液制备进行考察，通过考察溶解样品溶液的甲醇浓度、料液比进而确定最佳前处理方法。首先考察了样品溶液不同甲醇浓度（10%、30%、50%、70%和90%甲醇）作为溶剂的溶解效率，结果发现50%甲醇溶解效果较好（见图3），故后期优化选择50%甲醇作为溶解溶剂。加入甲醇重量体积比主要考察了 1∶10、1∶30、1∶50、1∶70 和 1∶100，结果发现当重量体积比达到1∶50时，检测出的黄芩苷含量基本不变。见图3。

图3 供试品制备考察

关于检测波长的选择，取对照品溶液和供试品溶液，利用DAD检测器对其进行190～400 nm范围内的紫外吸收光谱全波长扫描，黄芩苷的最大吸收波长为280 nm，因此，选择280 nm作为检测波长。液相色谱条件参照中国药典及其他黄芩苷含量测定相关研究［9-12］，最后优化为乙腈-0.1%甲酸水溶液＝30∶70（V／V）为流动相，等度洗脱，10 min 内即可完成检测。

本研究所建立的高效液相色谱法测定安胎饮合剂中黄芩苷含量，经过分析方法学的验证，表明该方法快速、准确，可用于安胎饮合剂的质量控制。

致谢：本项目在福建省科技厅重点实验室、福建省中药资源研究与开发利用重点实验室完成。