ε-聚赖氨酸盐酸盐与Nisin对蜡状芽孢杆菌的协同作用及机理

史文艳 孙 震

(1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

亚硝酸盐可促进肉制品发色、形成特有风味、延长肉制品货架期、抑制肉毒梭状杆菌生长及毒素产生等优势[1-5]，只要符合GB 2760的规定限量，在肉制品加工中添加亚硝酸盐是允许的。但亚硝酸盐不仅对其他致病菌如蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜杆菌的抑制作用微弱[6]，且存在潜在致癌风险[7-8]，因此，研究开发出比亚硝酸盐更安全的可用于肉制品的抑菌剂具有重要意义。

ε-聚赖氨酸盐酸盐(ε-PLH)具有广谱抑菌性，不仅可抑制革兰氏阳性菌(G+)及真菌，而且对部分革兰氏阴性菌(G-)也有强烈抑制作用。乳酸链球菌素(Nisin)对G+菌具有较强抑制作用，特别是对可生成芽孢的细菌，但对G-基本无抑制作用。现有研究还未发现某种食品抑菌剂单独使用就能有效抑制或杀死食品中所有微生物，抑菌剂复配使用不仅可降低单一抑菌剂使用量，而且还能增强抑制效果。本试验旨在研究ε-PLH与Nisin的联合抑菌作用及其机制，为ε-PLH和Nisin在低温肉制品中的复合应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.2 材料与试剂

蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)：江南大学食品学院实验室保存；

营养肉汤培养基、平板计数培养基：国药集团化学试剂有限公司；

ε-PLH：92.87%，江苏一鸣生物股份有限公司；

乳酸链球菌素(Nisin)：106IU/g，江苏一鸣生物股份有限公司；

碘化丙啶PI染色液：50 μg/mL，含RNase，上海源叶生物科技有限公司；

碱性磷酸酶试剂盒、AKP试剂盒、ATP酶试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒：南京建成生物工程研究所；

盐酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

2,4-二硝基苯肼：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

DNP试剂：精确称取594 mg 2,4-二硝基苯肼，溶于1 000 mL 2 mol/L HCl溶液中，摇匀完全溶解后，置于棕色瓶中，4 ℃保存备用。

1.1.3 仪器与设备

电子天平：FA2204B型，上海精科天美科学仪器有限公司；

手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅：SYQ-DSX-280B型，上海申安医疗器械厂；

新世纪紫外可见光光光度计：T6型，北京普析通用仪器有限责任公司；

隔水式恒温培养箱：GNP-9270型，上海精宏实验设备有限公司；

超净工作台：ZHJH-C1209C型，上海智城分析仪器制造有限公司；

高速冷冻离心机：CR21GⅢ型，日本日立公司；

流式细胞仪：FACSCalibur型，美国BD公司；

电泳仪：1645050型，美国伯乐公司；

化学发光凝胶成像系统：ChemiDoc XRS+型，美国伯乐公司。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 蜡状芽孢杆菌用牛肉膏蛋白胨培养基进行增殖培养，临用时用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释至所需菌浓度。

1.2.2ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌最小抑菌浓度(MIC)的测定 以蜡状芽孢杆菌为研究对象，采用试管二倍稀释法。以最后1根澄清试管内防腐剂的浓度计为能抑制蜡状芽孢杆菌生长的最低浓度。同时测定600 nm 处菌悬液的吸光值，得到关于ε-PLH和Nisin剂量和抑菌率的关系。按式(1)计算抑菌率。

(1)

式中：

I——抑菌率，%；

A1——阳性对照组的吸光值；

A0——阴性对照组的吸光值；

A——试验组的吸光值。

1.2.3ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌联合作用效果的测定 采用棋盘法，用试管代替96孔板。37 ℃培养18 h后肉眼观察结果，分光光度计测定600 nm处的吸光值，按式(2)计算分级抑菌浓度指数FICI，并判断相互作用类型。

FICI=MIC(A联合)/MIC(A单独使用)+MIC(B联合)/MIC(B单独使用)，

(2)

式中：

FICI——分级抑菌浓度指数；

MIC(A联合)、MIC(B联合)——分别表示联合使用时Nisin和ε-PLH的最小抑菌浓度，mg/L；

MIC(A单独使用)、MIC(B单独使用)——分别表示Nisin和ε-PLH单独使用时的最小抑菌浓度，mg/L。

FICI<0.5，协同作用；0.52，拮抗作用。

1.2.4 样品的处理 蜡状芽孢杆菌的菌悬液稀释至106CFU/mL，加入ε-PLH与Nisin溶液，使菌悬液中抑菌剂的终浓度分别为1/4 MICε-PLH，1/4 MIC Nisin，1/8 MICε-PLH+1/8 MIC Nisin，以等量无菌PBS替代防腐剂作为空白对照。

1.2.5ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌蜡状芽孢杆菌菌体活力的影响 根据文献[9]修改如下：样品经37 ℃培养4 h 后取出，加入PI染色液，避光作用15 min，流式细胞仪分析。

1.2.6ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌细胞壁完整性的影响 根据文献[10]修改如下：样品经37 ℃培养3 h后取1 mL菌液，4 ℃下3 500 r/min离心10 min。取100 μL上清，依次测定样品的AKP的活性。

1.2.7 ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌ATPase活力的影响 根据文献[11]修改如下：样品于5 000 r/min下离心5 min后弃去上清液，无菌生理盐水洗涤菌体并重悬；经超声波破碎后，12 000 r/min冷冻离心20 min，所得上清液备用。用ATP酶试剂盒进行测定。

1.2.8ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌代谢过程中丙酮酸含量的影响 根据文献[12]，采用DNP法对蜡状芽孢杆菌代谢过程中丙酮酸含量进行测定。所得丙酮酸含量的标准曲线方程为：y=0.040 1x+0.005 7，R2=0.999 6。

1.2.9ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌紫外吸收物的影响

根据文献[13]的试验方法，修改如下：菌悬液3 500 r/min 离心5 min，无菌PBS洗涤2次。37 ℃培养，于0，1，3，5，7，9，12 h取样，经0.22 μm滤膜过滤，测定260 nm处的吸光值。

1.2.10ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌菌体蛋白的影响

根据文献[14]的试验方法，修改如下：37 ℃培养3，6 h 后取样。3 500 r/min 离心10 min，取菌体沉淀，经PBS洗涤2次后用定量无菌水溶解，4 ℃下10 000 r/min 离心10 min，取上清液100 μL，加入25 μL上样缓冲液，沸水浴5 min，上样操作，进行SDS-PAGE电泳。

1.3 数据处理

Origin 9.0进行数据处理和分析，SPSS软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌MIC的影响

通过肉眼观察，得到ε-PLH、Nisin作用于蜡状芽孢杆菌的MIC分别为12.5，6.25 mg/L。结合ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌作用的抑菌率(见表1)可看出，随着ε-PLH、Nisin浓度的升高，抑菌率也逐渐增大，当ε-PLH、Nisin分别为12.5，100 mg/L时，可完全抑制蜡状芽孢杆菌的生长。由此说明，通过仅肉眼观察会造成很大的误差，影响结果的准确性。

2.2 ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌联合作用效果

ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌联合作用效果见表2。

由表2可计算出，FICI=0.25，FICI<0.5，故ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌具有协同抑制作用。

表1 ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌作用的抑菌率

表2 ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌联合作用效果

† “-”表示无菌落生长；“+”表示有菌落生长。

2.3 ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌细胞壁完整性的影响

细胞壁具有保护细胞抵抗外界不利因素、固定细胞外形、保证细胞完整性等功能。碱性磷酸酶通常位于细菌细胞壁与细胞膜之间，只有在细胞壁出现破损时，AKP才会从壁膜之间泄露出去。通过测定碱性磷酸酶的活性强弱，可判断出菌体细胞壁被破坏的程度。

由表3可知，与对照组相比，经ε-PLH、Nisin处理过的蜡状芽孢杆菌菌悬液中AKP含量均有所升高，尤其是ε-PLH、Nisin联合作用时AKP活力最高，说明细胞壁结构被破坏程度大，细胞壁通透性增加，推测可能会影响蜡状芽孢杆菌的生长和代谢活动。

ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌细胞膜的破坏作用与Chen等[15]所研究的大分子聚合抑菌剂对G+和G-细菌膜结构的破坏作用机制类似。其研究表明，由于细菌带负电，抑菌剂具有高的正电荷密度，静电相互作用很快使它们彼此接触。当亚硝酸盐细菌处于悬浮液中时，抑菌剂从细菌中置换表面二价离子如钙和镁，并与带负电荷的磷脂膜结合，迅速中和甚至逆转细菌的表面电荷，从而引起膜渗透性的轻微变化。该阶段，抑菌剂与细菌的相互作用是可逆的，当抑菌剂浓度更高时，相对高的浓度可使膜蛋白变性并开始渗透磷脂双层，膜渗透性的增加导致钾离子泄漏，使膜结构进一步不稳定。最终，高浓度的杀菌剂导致细菌膜完全崩解，起到杀菌作用。

表3ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌的AKP含量的影响†

Table3Effectofε-polylysinehydrochlorideandNisinonAKPcontentofBacilluscereus(n=3)

组别AKP活力/(King Unit·g-1·Prot)空白对照0.78±0.02a1/4 MIC ε-PLH0.93±0.03c1/4 MIC Nisin1.09±0.03b1/8 MIC ε-PLH+1/8 MIC Nisin1.45±0.04d

† 不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.4 ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌菌体活力的影响

碘化丙啶(PI)能够透过死亡细胞或破损的细胞膜而对DNA进行染色，不能透过活细胞膜，故常用于鉴定死细胞。通过流式细胞仪检测细胞数量和荧光强度的变化，可直观得出菌体的存活率和损伤情况[16-17]。

由图1可看出，与空白对照相比，经ε-PLH、Nisin作用后的蜡状芽孢杆菌的荧光强度明显增大，表明细胞壁膜结构均遭到破坏，细胞膜通透性增大。ε-PLH、Nisin联合作用时荧光强度最大，菌体被破坏的程度最大，菌体活力最低，表明ε-PLH、Nisin 对蜡状芽孢杆菌具有协同抑制作用。

图1 ε-PLH、Nisin作用蜡状芽孢杆菌经PI染色后的

Figure 1 Flow cytometry analysis of ε-polylysine hydrochloride and Nisin acting on Bacillus cereus by PI staining

2.5 ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌ATPase活力的影响

ATPase存在于组织细胞及细胞器的膜上，在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要作用。通过检测ATPase的含量，可以间接地反映出ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌能量代谢过程的影响。

由表4可看出，经过ε-PLH、Nisin处理过的蜡状芽孢杆菌Na+K+-ATPase活力显著下降，说明能量代谢过程受阻，经ε-PLH、Nisin联合处理的蜡状芽孢杆菌ATPase活力最低，结合对细胞壁的完整性的影响，推测可能是Nisin主要作用于破坏细胞膜结构而增加细胞壁膜的通透性，使ε-PLH更容易作用于蜡状芽孢杆菌的内部结构，导致菌体代谢活动受阻，影响蜡状芽孢杆菌的生长和代谢活动。

表4ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌Na+K+-ATPase活力的影响†

Table4Effectofε-polylysinehydrochlorideandNisinontheactivityofBacilluscereusNa+K+-ATPase(n=3)

组别Na+K+-ATPase活力/(U·mg-1·Prot)空白对照24.62±0.25a1/4 MIC ε-PLH11.82±0.30c1/4 MIC Nisin15.32±0.38b1/8 MIC ε-PLH+1/8 MIC Nisin10.28±0.19d

† 不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.6 ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌代谢过程中丙酮酸含量的影响

丙酮酸是机体代谢的中间产物，处于糖酵解途径的末端，同时它又连接着EMP途径和TCA循环。作为能量代谢的中间产物，丙酮酸含量的多少可间接反映代谢活动的进程。

由图2可看出，蜡状芽孢杆菌代谢过程中丙酮酸含量经历了升高、下降再升高的过程。与对照组相比，经过1/4 MICε-PLH、1/4 MIC Nisin单独处理过的蜡状芽孢杆菌菌悬液中，丙酮酸含量变化不大；但经过1/8 MICε-PLH 与1/8 MIC Nisin联合处理过的蜡状芽孢杆菌菌悬液中，丙酮酸含量显著下降，说明二者联合作用影响甚至阻碍了蜡状芽孢杆菌的能量代谢过程。

图2 ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌代谢过程中丙酮酸

Figure 2 Effect ofε-polylysine hydrochloride and Nisin on pyruvate content in the metabolism ofBacilluscereus

2.7 ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌紫外吸收物的影响

核苷酸类物质在260 nm处有强吸收，如果细菌膜受损，可通过检测260 nm处的吸光度而估计出从细胞质释放的DNA和RNA的量，从而评定细胞膜的完整性。

由图3可看出，对照组基本无紫外吸收，而经ε-PLH、Nisin处理后的蜡状芽孢杆菌菌悬液的紫外吸收均有所增加，说明蜡状芽孢杆菌的细胞膜结构受到了不同程度的破坏，导致细胞内容物的渗漏，从而进一步影响菌体代谢和生长。经ε-PLH、Nisin联合处理后，菌悬液紫外吸收值最大，说明联合使用后菌体细胞膜破损程度最高，与AKP结果相对应。从而进一步证明了ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌具有协同抑制作用，其中Nisin对蜡状芽孢杆菌的细胞膜结构的破坏程度要强于ε-PLH，说明二者联合使用时Nisin主要作用是破坏膜结构，而ε-PLH则是影响代谢活动。

图3 ε-PLH、Nisin对蜡状芽孢杆菌紫外吸收物

Figure 3 Effect ofε-polylysine hydrochloride and Nisin on the content of UV absorption ofBacilluscereus

2.8 ε-PLH与Nisin对蜡状芽孢杆菌菌体蛋白的影响

对菌体总蛋白的SDS-PAGE分析可证明抑菌剂能否影响和阻碍细胞内蛋白质的表达。

与对照组相比，经ε-PLH处理过的蜡状芽孢杆菌菌体蛋白质(2，4，6，8泳道)中，小分子蛋白质尤其是<10 kDa分子量的蛋白质明显增多，说明ε-PLH可能影响了蛋白质的合成和分解过程，可将大分子蛋白质分解成小分子蛋白质。经1/4 MIC Nisin处理后，电泳条带无明显变化；经1/8 MICε-PLH+1/8 MIC Nisin处理后，大分子量蛋白质条带颜色变浅，小分子蛋白质增多且颜色加深，说明二者联合作用对菌体的蛋白质表达和正常代谢有一定抑制作用，且这种作用随着培养时间的延长而增强。

3 结论

ε-PLH、Nisin抑制蜡状芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为12.5，6.25 mg/L，并且二者具有协同抑制作用。协同抑菌机理为：Nisin首先破坏细胞壁胞膜，当菌体的细胞膜受损后，半透性丧失、流动性减弱、细胞的内容物外泄。随后ε-PLH进入细胞胞内，抑制了细胞膜上的ATP酶活力、影响蛋白的合成和表达、导致细胞内多种代谢途径受阻，同时影响细胞膜的稳定性和多种酶的反应活性，达到协同抑菌的效果。后续研究可考虑在DNA分子水平或结合蛋白组学进一步探究ε-PLH、Nisin的协同抑菌机制。

1～4分别为对照组，经过1/4 MIC ε-PLH，1/4 MIC Nisin以及1/8 MIC ε-PLH+1/8 MIC Nisin处理3 h后的电泳条带；5～8分别为对照组，经过1/4 MIC ε-PLH，1/4 MIC Nisin以及1/8 MIC ε-PLH+1/8 MIC Nisin处理6 h后的电泳条带。

图4 ε-PLH、Nisin作用下蜡状芽孢杆菌菌体蛋白的SDS-PAGE电泳

Figure 4 SDS-PAGE electrophoresis ofBacilluscereusbacterial protein under the action of ε-polylysine hydrochloride and Nisin