谷朊粉肽美拉德反应中间体的制备及风味形成能力研究

孙福犁 徐 慢 崔和平 于静洋 张晓鸣

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

美拉德反应是发生在羰基化合物与氨基化合物之间的一种重要的非酶促相互作用[1-2]。美拉德反应整个过程非常复杂，在初级阶段，羰基与氨基缩合形成加成物，加成物快速脱水形成希夫碱。经环化形成N-葡糖胺，再重排形成更稳定的Amadori或Heyns重排产物(ARP或HRP)[3]，ARP和HRP也称为美拉德反应中间体(Maillard reaction intermediates，MRIs)。MRIs是极其重要的非挥发性香气前体，化学性质相对稳定，在室温下不易形成芳香物质或类黑精[4]。且MRIs在食品后续加工过程中可快速产生新鲜的风味，并为消费者提供烹饪愉悦感[5]。因此，美拉德反应产物(Maillard reaction products，MRPs)的香气挥发性问题有望通过在食品中添加MRIs来解决。

美拉德反应产生的香气物质主要来源于氨基酸的Strecker降解，然而单独氨基酸和还原糖的美拉德反应只能形成单一风味，难以满足香气丰富性的要求。例如，果糖—苯丙氨酸制备的中间体被用作花香味前体物[6]；木糖—半胱氨酸制备的中间体可在热处理时产生肉类风味[7]。据文献[8]报道，谷朊粉蛋白的总氨基酸含量和每种必需氨基酸皆较高，可作为优质的蛋白质来源。以蛋白质含量高的谷朊粉为原料，通过酶解手段将蛋白质转化成小肽等物质，可为研制天然MRIs提供丰富的风味前体物质。

目前为止，美拉德反应大多数是在有机相和水相中进行，少量发生在固相体系和乳液体系。在无水甲醇或其他有机溶剂中MRIs的合成成本较为昂贵且可导致环境污染，仅适用于理论研究，不能满足工业生产需要。因此，本研究拟以水作为美拉德反应的溶剂，基于半胱氨酸和中间体在水溶液中的反应机制，优化和调控中间体的形成条件。然后，进一步评估中间体在焙烤土豆片中的风味形成能力，并与MRPs的风味形成能力进行比较。以期为肽类和还原糖制备MRIs提供一种新的方法，并进一步开发出快速产生风味的稳定前体物。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

谷朊粉肽：食品级，安徽强旺调味食品有限公司；

集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S型，巩义市予华仪器有限责任公司；

发 行： 国内邮发代号：8-276 国际邮发代号：BM 4887 每期10.00元，全年120.00元

C6～C26正构烷烃：标准品，美国Sigma公司；

土豆、盐：市售。

NATO的标准化机构是NATO标准化办公室（NSO），总部设在比利时布鲁塞尔，成立于2014年，其前身是NATO标准化机构（NSA），是合并了军方标准化机构与NATO标准化办公室后形成的，由NATO标准化机构负责人（DNSA）直接领导。

1.1.2 仪器与设备

电子天平：EL104型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

(2) GC条件：毛细管色谱柱为DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为He，流速1.8 mL/min，不分流；起始柱温为40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升温至80 ℃，再以10 ℃/min的速率升温至160 ℃，保持0.5 min，再以2 ℃/min的速率升温至175 ℃，最后以10 ℃/min 的速率升温至230 ℃，保持7 min。

pH计：DELTA320型，瑞士Mettler Toledo公司；

盐酸、氢氧化钠、木糖、L-半胱氨酸、1,2-二氯苯等试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-1800型，岛津(中国)有限公司；

采用了2001-2014年共计14年的MODIS NDVI、降水、气温及生态区划数据。通过在ENVI中使用最大值合成法(Maximum Synthesis Method,MVC)对14年的NDVI数据进行处理，除去如大气、太阳高度、云层等干扰因素，计算黄土高原14年的NDVI值。降水与气温数据来自中国气象科学数据共享服务网[7]，黄土高原的生态区矢量数据来自中国生态系统评估与生态安全数据库[8]，中国生态区的划分标准根据城市与区域国家重点实验室在中国生态功能区划研究的前期基础数据，并参照国家环境保护总局发布的《生态功能区划(暂行)规程》。

家宝德烤箱：E5200型，德国UKOEO公司；

三重四级杆气质联用仪：TSQ Quantum XLS型，美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 方法

由图3可知，热处理期间MRIs中挥发性风味物质的总含量呈先快速增加而后平缓的趋势，且在加热时间为10 min时挥发性风味物质的总含量达到最大值(277.88 ng/g)。随加热时间的延长，挥发性风味物质含量在最大值间波动，可能是Amodori产物的烯醇化和降解反应所致，并导致形成更稳定的风味物质，如酮类、醇类、醛类和呋喃等[12]。然而，在热处理期间，MRPs中挥发性风味物质的总含量显著降低(P<0.05)，可能源于加热时MRPs中不稳定风味组分的挥发。MRPs中一些具有氨基、羰基、芳香族等活性官能团的特征风味物质，在热处理过程中易经历一系列复杂反应而形成更多的类黑精[13]。与加热过程中MRPs溶液中的风味物质相比，MRIs溶液中醛类、吡嗪类和呋喃类化合物的含量明显增加，且此类化合物均属常见焙烤食品香气化合物[14]。有研究[15]报道，醛类化合物中的甲硫基丙醛具有泥土味和类似马铃薯味，虽然浓度低，但因其具有较低的检测阈值而极易被检测到。在马铃薯焙烤过程中，吡嗪被认为是最重要、最典型的烤马铃薯风味组分[16]，加热后MRIs中2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-异丁基-3-甲基吡嗪等吡嗪类总含量呈增加趋势。以上结果表明，在模拟焙烤土豆片的升温程序下，谷朊粉肽MRIs不仅可快速产生大量风味物质，且添加至焙烤土豆片中有望使其香气成分更加浓郁。

按制备谷朊粉肽MRIs时的谷朊粉肽和木糖浓度配制美拉德反应溶液，在120 ℃下反应120 min，得到谷朊粉肽MRPs溶液。

1.2.2 谷朊粉肽MRIs、MRPs的制备 通过测量变温美拉德反应产物的褐变程度(A420)来确定中间体形成的关键条件。MRIs形成的临界条件即变温美拉德反应产物色泽(A420)最低点所对应的第一阶段低温反应条件。在不添加半胱氨酸的情况下，制备来自谷朊粉肽和木糖的MRIs，第一阶段低温反应结束后立即在冰水中终止反应，此产物即谷朊粉肽MRIs。

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1.2.3 焙烤土豆片的制备 将土豆切成3 mm左右的薄片，泡水除去淀粉，捞出后，晾干，两面刷适量的油和盐，并添加一定量的谷朊粉肽MRIs和MRPs。烤箱设定为190 ℃，预热10 min，将土豆片放入烤箱中，焙烤20 min。焙烤结束后，自然冷却，并取样进行下一步分析。

1.2.4 挥发性风味物质的测定

(1) SPME条件：5.0 g样品添加0.015 μg/μL 1,2-二氯苯甲醇内标溶液10 μL。采用100 μm DVB/CAR/PDMS萃取头在60 ℃下吸附30 min，再在250 ℃下解吸7 min。

磁力搅拌器：C-MAG-HS7型，德国IKA公司；

1.2.5 数据分析 使用Excel 2016制表，SPSS 19.0对数据进行显著性分析，Origin 9.0绘图；用Unscrambler X 10.4进行主成分分析(PCA)；GC/MS数据处理由Xcalibur软件系统完成，未知化合物经计算机检索。所有数据为3次重复试验的平均值。

温度控制方案如图2所示。在该方案中，温度传感器测到的室内温度值与给定的温度值的差值输入到控制器，控制器通过特定的算法用脉冲控制步进电机，步进电机与电动阀连接，通过转动控制电动阀阀门的开度，进而控制管道内液体的流量，最终改变室内的温度。温度传感器将检测到的实时温度与给定温度进行比较，差值再次送入控制器，控制器通过步进电机改变管道液体流量，使温度降低的速度加快或减慢，最终使室内温度与给定温度匹配。

法谚有云：杀人偿命，天经地义。这是法律报应理念最直接的体现。在中国传统的伦理观念——亲亲尊尊与忠孝节义的影响下，对杀害“尊亲”的人复仇是一种义务，更是一种责任。这样的血亲复仇的观念导致民众采用私刑的方式来解决纠纷，从而不利于社会的稳定，也会威胁到统治者的统治。故国家创设了死刑制度以代替血亲复仇，由国家作为公权力机关行使执行死刑的权力，从而将报应观念落实到行动中。

(3) MS条件：EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，接口温度250 ℃，检测器电压1 000 V，扫描质量范围35～450 amu。

2 结果与分析

2.1 制备条件的确定

二阶段变温美拉德反应是一种用于检测水相中MRIs形成的简单有效的方法，只需以半胱氨酸为示踪剂，无需使用任何标准物质和高效液相色谱的分析[5,9]。对于蛋白酶解液等复杂的美拉德反应体系，使用标准物质和高效液相色谱检测MRIs是不切实际的。因此，此方法将为确定和调控MRIs制备条件提供一定参考。其主要是基于半胱氨酸作用于Amadori重排产物可有效抑制色泽物质形成的机理，通过比较终产物色泽抑制效果来确定MRIs制备的关键条件。

反应分成2个阶段，第一阶段反应温度分别为80，90，100 ℃，反应时间0～100 min，即低温反应阶段；第二阶段加入半胱氨酸，迅速升温至120 ℃，反应110 min，即高温反应阶段；图1反映了低温反应温度对美拉德反应终产物褐变程度(A420)的影响。

根据类似工程资料，NM360耐磨性能不低于普通钢板的两倍。其焊接性能与普通钢板类似，但其可切削性能较低，尤其是钻孔比普通钢板略困难。根据笔者调研，在过煤面较大的螺旋溜槽入料段以及刮板输送机槽箱内采用该耐磨衬板效果良好。

图1 反应温度对二阶段变温MRPs褐变程度的影响

Figure 1 Effect of first stage reaction temperature on browning (A420) of MRPs performed under two stepwise increase of temperature

由图1可知，在80，90，100 ℃条件下，不同时间添加半胱氨酸，变温MRPs的褐变程度(A420)均呈现先降低后上升的趋势；80，90，100 ℃下的色泽最浅点分别为60，30，20 min时添加半胱氨酸。说明半胱氨酸的添加时间对二阶段变温美拉德反应中褐色物质的形成具有重要影响，由于半胱氨酸和MRIs之间的相互作用有效抑制了次级反应产生褐变物质，并且MRIs含量越高，半胱氨酸和MRIs之间相互作用越强，二阶段变温MRPs的A420也越小。

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若要最大程度抑制二阶段变温MRPs的褐变程度，必须严格控制半胱氨酸的添加时间，时间过早或过晚均将会影响抑制效果，这些研究结果与Huang等[9]、Cui等[10]报道基本一致。当第一阶段反应温度为80，90，100 ℃ 时，MRIs出现最大含量的时间分别为60，30，20 min。然而，90，100 ℃时二阶段变温MRPs色泽(A420)明显比80 ℃反应终产物色泽加深，主要源于较高温度下，MRIs形成后可快速发生烯醇化和降解等次级反应而进入美拉德反应中期阶段，从而导致MRIs含量明显降低，说明相对温和的条件(80 ℃)有利于MRIs的形成和积累[2]。因此，最终确定MRIs的最优制备温度和时间分别为80 ℃和60 min。

2.2 加工风味受控形成分析

2.2.1 加热曲线 在最优条件下制备MRIs后，为进一步研究其风味形成能力，测定了其模拟焙烤土豆片升温程序的加热曲线。据文献[11]报道，谷朊粉经过酶解后，酶解液中的总氨基酸含量较高，并且谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸等氨基酸占有较大比例。由于氨基酸种类在很大程度上影响着MRPs的风味特征，而焙烤土豆片固有的风味较为单一，故将谷朊粉肽MRIs应用到焙烤土豆片中，有望丰富其原有风味特征，并辅以焙烤土豆片一定的色泽和营养价值。由图2可知，MRIs溶液与焙烤土豆片的加热曲线较为吻合。随加热时间的延长，两个体系的温度均呈先升高而后趋于平稳；但焙烤土豆片和MRIs溶液的加热曲线存在一些差异，这是由于MRIs溶液为水溶液体系，而马铃薯成分复杂，含有大量的水、碳水化合物、蛋白质等。MRIs溶液温度上升速度稍快于土豆片，但两曲线差异并不明显，因此，可在焙烤土豆片的升温程序下，对谷朊粉肽MRIs溶液进行加热处理，进一步分析其在模拟焙烤土豆片升温程序时的风味形成能力。

图2 谷朊粉肽MRIs和土豆片在焙烤过程中的加热曲线

2.2.2 挥发性风味成分变化 按制备MRIs时的谷朊粉肽和木糖浓度配制美拉德反应溶液，于120 ℃下反应120 min，得到MRPs溶液；同时按最适条件制备谷朊粉肽MRIs溶液。将2种样品溶液置于190 ℃烤箱中分别加热0，5，10，15，20 min后定时取样，采用SPME/GC-MS分析样品的挥发性风味物质。2种样品中挥发性物质的含量随加热时间的变化如图3所示。

1.2.1 二阶段变温美拉德反应及褐变程度的测定 取适量谷朊粉肽配成一定浓度的溶液，按谷朊粉肽固形物含量的15%添加木糖，并混合均匀，6 mol/L NaOH溶液调节pH至7.4。将溶液分装在耐温耐压反应瓶中，于一定低温(80，90，100 ℃)下反应一段时间(0～2 h)后，取出冷却。然后添加1.00%半胱氨酸，并用6 mol/L NaOH溶液重新调节pH至7.4。迅速将溶液温度升高至120 ℃，反应110 min后，立即冰浴停止反应。将反应终产物用蒸馏水稀释5倍，以去离子水做空白，在420 nm下测定吸光值A420，每个样品重复测定3次，取平均值。

图3 加热时间对MRIs和MRPs中挥发性风味物质的影响

2.3 对焙烤土豆片色泽和风味的影响

2.3.1 色泽 食品加工中形成的颜色是影响顾客对食品感知的最重要参数之一，同时，颜色形成与热处理过程发生的美拉德反应密切相关。美拉德反应可产生大量香气成分，但也是引起焙烤土豆片颜色变深的主要原因之一。虽有偏向浅色的视觉倾向，但被蒙上眼睛的感官评定小组成员都选择了更具味道和气味的深色马铃薯片[17]。为了获得色泽均匀的浅色焙烤土豆片，本研究考察了不同添加量的MRIs和MRPs对焙烤土豆片色泽的影响，结果如图4所示。

导数应用的所有问题都以研究导函数f′(x)的零点, 即方程f′(x)=0的解为基础, 当断定方程f′(x)=0有解, 但又发现其解不能求或不易求时, 就可引导学生提出新的解题构想，即“设而不求 整体代入”的方法.

图4显示，添加MRPs组的色泽明显高于空白组和添加MRIs组，说明MRPs在后续的加热处理过程中，美拉德反应进入终期反应阶段，终产物类黑素含量明显增多，从而导致焙烤土豆片发生严重褐变[12]。且MRPs添加量越多，焙烤土豆片褐变程度越大，严重偏离消费者对色泽感官的喜好。与空白组相比，添加MRIs的焙烤土豆片褐变程度较小，色泽较为均匀，表面有光泽，未出现过焦或过白的情况，表明MRIs继续发生次级反应产生中期产物，但未完全进入终期阶段，产生类黑精的含量较少，从而使得焙烤土豆片褐变程度较浅，并改善了其原有色泽。

图4 不同添加量的MRIs和MRPs对土豆片色泽的影响

2.3.2 挥发性风味成分 香气特性是焙烤土豆片品质及大众接受度的重要因素，焙烤土豆片的香味主要取决于其所含的挥发性芳香物质[18]。为更充分了解添加MRIs和MRPs对焙烤土豆片在挥发性风味物质种类及含量上的差异，采用GC/MS对其进行分析，结果如表1、2所示。

由表2所示，醛类物质在所有检测样品中所占比例最大，主要来源于不饱和脂肪酸的降解以及土豆和谷朊粉肽链上的氨基酸的Strecker降解。其中己醛主要呈现出花香、果香和青草香，是典型的不饱和脂肪酸的氧化产物，通常被视为脂质氧化的标记物[19]。在Strecker醛中相对含量最高的3-甲基丁醛具有麦芽、水果、巧克力香气；甲硫基丙醛呈现出泥土味和类似马铃薯味；苯甲醛、苯乙醛分别呈现出坚果香气和花香[20]。MRIs组的Strecker醛的相对含量均高于空白组和MRPs组，表明MRIs迅速发生降解、环化聚合等次级反应，影响美拉德一系列反应，进而导致Strecker醛有所增加。随MRIs添加量的增加，Strecker醛的相对含量增加，且添加量在1.0% 时到达峰值(468.639 ng/g)，赋予了焙烤土豆片特有的香气。

吡嗪类化合物是典型的MRPs，此类化合物可强烈地影响焙烤食品的香气[21]。有研究报道，在烤马铃薯[22]和薯片[17]中吡嗪含量和感官品质具有极显著的正相关性。所有的吡嗪类化合物都可以提供烘烤香，但2,5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪可能是最重要的焙烤土豆香气的贡献者。从表1可以看出，吡嗪类化合物的含量从0.5% MRIs下的14.007 ng/g 增加到1.0% MRIs下的53.351 ng/g，极大地增强了土豆片的焙烤香气。

呋喃化合物具有青草香和果香，对焙烤土豆片的总体风味轮廓有重要贡献[23]。添加1.0% MRIs的烤制土豆片中的呋喃类化合物含量为41.788 ng/g，明显高于其他样品。呋喃类化合物可能是由还原糖降解产生，含量虽少，却是形成杂环化合物的重要中间体，对马铃薯香气的形成起到不可忽视的作用。烃类物质阈值较高，风味特征不明显，对烤制土豆片的风味贡献较小。

中国期刊全文数据库中以“Meta分析”冠名的中医药文献计量分析 ………………………………………… 徐 蕴等（20）：2862

表1 焙烤土豆片中挥发性风味物质含量

表2 焙烤土豆片中挥发性风味物质含量汇总†

† ND表示样品中未检测出。

2.3.3 挥发性风味物质的主成分分析 主成分分析(PCA)更为直观地揭示了添加MRIs和MRPs的焙烤土豆片在挥发性风味物质种类和含量上的差异。如图5所示，PC1和PC2分别解释了52%和32%的变量，总贡献率为84%，此数据说明PCA能较好地反映变量信息。5个样品之间表现出显著差异，空白、0.5% MRPs、1.0% MRPs在PCA图的右侧，与大部分挥发性风味成分都不具有相关性。而0.5% MRIs、1.0% MRIs在PCA图的左侧，并且随添加量增大而向左移动，同时与越来越多的挥发性物质呈现相关性。大部分醛类、吡嗪类和呋喃化合物与1.0% MRIs相关性较高，位于PCA的左上象限，说明它所含挥发性风味物质种类较多，且挥发性化合物在此样品中含量较高。总体而言，PCA能揭示添加MRIs及MRPs的焙烤土豆片在挥发性化合物组成上的差异；与空白和MRPs试验组相比，MRIs试验组具有更丰富的挥发性风味物质轮廓。

图5 主成分分析图

3 结论

本研究通过二阶段变温美拉德反应确定谷朊粉肽和木糖的美拉德反应中间体的最佳制备条件：反应温度80 ℃，反应时间60 min。模拟焙烤土豆片的升温程序，发现谷朊粉肽MRIs可快速产生大量的醛类、吡嗪类和呋喃类等风味化合物。在焙烤土豆片中添加谷朊粉肽MRIs不仅能辅以焙烤土豆片诱人的色泽，还能丰富焙烤土豆片的风味轮廓，强化其香气特征。谷朊粉肽美拉德反应中间体作为即将投放市场的新产品，除风味特征外，其他性质也尤为重要，如该产品的加工适用性、稳定性等。后续可针对不同焙烤食品的应用特性，开展系列研究，为实际生产提供理论依据。