高抵抗素血症介导的自发性高血压大鼠左室肥厚与GLUT4的相关性

韩彬，张卫，曾卓，周玉良，郑志鹏，李炽昌

抵抗素是由脂肪细胞分泌的一种信号分子，它通过影响葡萄糖的代谢来对抗胰岛素的功能，是联系肥胖与胰岛素抵抗之间的一种新型独特信号分子。有研究显示抵抗素水平与左室重量以及心肌功能障碍是独立相关的[1]，但机制尚不明确。葡萄糖转运体4（GLUT4）是存在于细胞膜上的一种葡萄糖转运蛋白，是目前已知的14种促进跨膜己糖转运体葡萄糖转运体（GLUT）家族成员之一，主要存在于脂肪组织、骨骼肌及心肌组织中，是心肌组织功能的重要组成部分，GLUT4水平与左室肥厚的发生有一定联系[2]，但抵抗素导致的左室肥厚是否与GLUT4水平变化有关，尚无相关报道。本研究在高血压大鼠的基础上，通过注射载有抵抗素基因的腺病毒，以观察不同水平的抵抗素对肥厚心肌组织中GLUT4表达的影响，探索抵抗素导致左室肥厚的分子学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂10周龄自发性高血压大鼠（SHR）36只（北京维通利华实验动物技术有限公司），雄性，体重（220±15）g，载有抵抗素的重组腺病毒（上海吉凯基因化学技术有限公司）；大鼠抵抗素（Resistin）ELISA检测试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司）；兔抗鼠Tubulin一抗、兔抗鼠GLUT4一抗以及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（碧云天生物技术有限公司）。

1.2 研究分组将36只10周龄高血压大鼠（雄性），随机平均分成病毒组及空白对照组（每组各18只）。其中病毒组经尾静脉注射载有抵抗素基因的重组腺病毒（上海吉凯基因化学技术有限公司提供）1×108PFu/mouse（用生理盐水稀释至0.3 ml）5 d后随机平均分成第1周组、第4周组、第8周组3组（每组6只）；而空白对照组则经尾静脉注射等体积生理盐水后随机平均分为第1周组、第4周组、第8周组3组（每组6只）。

1.3 评价指标

1.3.1 左室重量指数、胰岛素及抵抗素水平于对应周数测量大鼠体重，取材，采集清晨空腹12 h以上的大鼠静脉血3～4 ml，半数采用放射免疫法检测空腹胰岛素水平，另一半离心后取血清储存在-70 ℃冰箱中，采用竞争性酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血清抵抗素水平，试剂配置及操作均按照说明书进行；分离左心室，生理盐水冲洗后滤纸吸干水分，测定左室重量并计算重量指数。

1.3.2 心肌组织HE染色心肌组织经甲醛固定24 h，经脱水、包埋后经病理切片设备（常州市郝思琳医用仪器有限公司）进行切片，常规HE染色，观察心肌细胞形态及结构变化。

1.3.3 Western blot检测心肌组织中GLUT4水平4℃PBS漂洗心肌组织，称取100 mg组织并剪碎，加入1ml 4 ℃预冷的组织裂解液，反复研磨至无组织块，吸取研磨器中液体4 ℃ 12000 g离心15min，取上清液用Lowry法测定蛋白质浓度。配置10%分离胶和5%浓缩胶，向加样孔中加入30 μg总蛋白和预染Mark 3 μl，以80 V电压电泳30 min后换用120 V继续电泳90 min，用湿转法将蛋白转到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜用5%的脱脂牛奶封闭1 h后，TBST缓冲液洗膜3次，加入兔抗鼠Tubulin一抗（1：1000稀释）及兔抗鼠GLUT4一抗（1：1000稀释），4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗，经TBST缓冲液冲洗后，加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，摇床孵育1 h。TBST缓冲液冲洗，使用超敏ECL化学发光试剂盒进行发光，在暗盒胶片上曝光1～5 min，显影、定影后观察结果，采用ImageJ图像分析系统对条带进行扫描和分析。

1.4 统计学分析使用SPSS 19.0数据分析软件对数据进行统计分析处理，各组计量资料数据用均数士标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 高抵抗素血症大鼠模型的鉴定采用ELISA检测试剂盒检测各组大鼠抵抗素水平，病毒组大鼠血清抵抗水平在第1周及第4周较对照组明显升高（P＜0.05）（表1）。

2.2 抵抗素对空腹胰岛素及左室重量指数的影响与对照组相比，病毒组空腹胰岛素水平在第1周以及第4周组中显著性升高（P＜0.05），在第4周及第8周组中，病毒组左室重量指数较对照组显著增高（P＜0.05）（表2）。

表1 各组大鼠的血清抵抗素的比较（±s）

表1 各组大鼠的血清抵抗素的比较（±s）

注：与对照组相比，aP＜0.05

分组 抵抗素（μ g/L）病毒组 第一周 1.9 5±0.1 0 a第四周 2.4 8±0.2 9 a第八周 2.2 0±0.1 9对照组 第一周 1.3 0±0.0 9第四周 1.9 9±0.2 6第八周 2.1 8±0.2 5

表2 各组大鼠空腹胰岛素及左室重量指数的比较（±s）

表2 各组大鼠空腹胰岛素及左室重量指数的比较（±s）

注：表示与对照组相比，aP＜0.05

分组 胰岛素（m I U/L） 抵抗素（μ g/L）病毒组 第1周 1.1 2±0.2 9 a 3.1 2±0.1 2第4周 1.3 5±0.1 2 a 3.8 8±0.1 4 a第8周 0.8 8±0.1 8 3.9 2±0.1 5 a对照组 第1周 0.8 1±0.0 7 3.1 5±0.1 5第4周 0.9 0±0.0 8 3.3 1±0.0 9第8周 0.8 5±0.1 4 3.3 5±0.1 1

2.3 大鼠心肌细胞形态及排列变化第1周组中，病毒组大鼠心肌细胞与对照组相比，细胞形态及排列改变轻微。在第4周组中，病毒组大鼠较对照组大鼠心肌细胞肥大，排列紊乱，而在第8周组，病毒组大鼠心肌细胞改变更加明显，部分心肌纤维断裂，胞浆溶解坏死，心肌组织间边界模糊（图1）。

2.4 心肌组织中GLUT4的表达灰度分析显示，在第1周、第4周及第8周中，对照组GLUT4水平较病毒组明显升高，GLUT4水平与抵抗素呈负相关（P＜0.05）（图2～3）。

2.5大鼠心肌组织GLUT4与血清抵抗素水平的相关性分析显示抵抗素水平与GLUT4呈负相关（r=-0.45，P=0.006）（图4）。

图1 大鼠心肌细胞形态及排列变化

图2 心肌组织中GLUT4及Tubulin的表达

图3 病毒组与对照组心肌组织中GLUT4的表达

2.6 不同组大鼠心肌组织中GLUT4的mRNA的表达β-actin及GLUT4的溶解曲线均呈单峰，无杂峰，提示无非特异性二聚体类产物，荧光定量结果可靠，对比病毒组与对照组GLUT4的mRNA的Real-time PCR结果，第1周、第4周及第8周组，病毒组GLUT4的mRNA的表达较对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（图5～6）。

2.7 大鼠心肌组织中GLUT4 mRNA水平与抵抗素水平分析抵抗素水平与GLUT4 mRNA水平呈负相关（r=-0.415，P=0.012）（图7）。

3 讨论

左室肥厚是心脏为了适应过度的压力负荷发生的心肌重构，表现为心肌细胞的肥大以及心肌的纤维化，是心衰、心律失常、心梗等不良事件的危险因素之一[3]，在高血压患者中有20%～40%合并有左室肥厚的发生，我们前期[4]的临床研究发现，高血压患者血清抵抗素与左室肥厚呈正相关，可能是左室肥厚发生、发展的重要影响因素之一。

图4 抵抗素水平与GLUT4的相关性分析

图5 GLUT4及内参的扩增及溶解曲线

图6 病毒组与对照组GLUT4 mRNA表达

图7 抵抗素与GLUT4 mRNA水平的相关性分析

GLUT4是心肌组织供能的重要环节，研究发现在糖尿病心肌病中GLUT4的表达下降[5]，这种现象也存在于小鼠扩张型心肌病[6]及长期大量摄入酒精的大鼠心肌中[7]，GLUT4基因敲除的小鼠可以出现显著心肌肥厚[8]。类似于上述研究，我们的研究发现，通过注射载有抵抗素基因的重组腺病毒，病毒组与对照组相比，抵抗素水平明显上升，心肌组织中GLUT4的表达量明显下降，心肌的左室重量指数增加，由此我们认为肥厚心肌中的GLUT4表达是下降的，并且GLUT4表达的下调与抵抗素水平的上升有关。

故抵抗素可以通过下调高血压大鼠心肌GLUT4的表达而导致左室肥厚的发生。我们的研究发现，抵抗素水平的升高可以引起高血压大鼠体内胰岛素水平的增高、胰岛素抵抗的发生。胰岛素抵抗可能通过以下几种机制引起大鼠心肌组织GLUT4表达下降：①胰岛素水平升高导致一些微小RNA过表达，如miR-93、miR-223[9,10]，从而引起组织中GLUT4表达量的下降；②代谢综合症大鼠有胰岛素抵抗状态，心肌组织中GLUT4表达下降，其中白介素-6（IL-6）、C反应蛋白（CRP）以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）炎症介质水平的升高可能起一定的作用[11]；③糖尿病合并有严重的胰岛素抵抗的患者，肌肉组织中的GLUT4表达的下降与泛素结合酶9（UBC9）表达的下降有关[12]；④在骨骼肌胰岛素抵抗模型中，胰岛素抵抗可以通过影响p38MAPK途径来影响GLUT4的表达，使用改善胰岛素抵抗的药物后骨骼肌中GLUT4的水平上升[13]；⑤苦瓜提取物也能改善胰岛素抵抗，引起肌肉组织中GLUT4表达的上升[14]。

综上所述，本文认为GLUT4表达的下降在抵抗素介导的高血压大鼠左室肥厚中发挥着一定的作用，抵抗素水平的升高导致了高血压大鼠胰岛素抵抗的发生，通过上述可能的途径引起了GLUT4的表达量下降，最终导致了大鼠左室肥厚的发生。这一现象的发现，不仅为高血压合并左室肥厚患者的治疗提供了新靶点，同时也为高血压患者合并高抵抗素血症的干预提供了新的证据。