高效液相色谱－串联质谱法测定食品、保健食品中2－羟基丙基去甲他达拉非

农毅清，刘珈伶，袁光蔚，韦 环，廖 强，覃文霞，刘欣宜

（广西－东盟食品药品安全检验检测中心，广西 南宁 530001）

近年来，在一些宣称具有补肾壮阳、增强性功能特效的抗疲劳类食品及保健食品中检出包括西地那非、他达拉非等磷酸二酯酶5抑制剂（phosphodiesterase5，PDE－5）。PDE－5抑制剂是治疗勃起功能障碍的一线经典处方药［1］。但PDE－5抑制剂的用药及用量有严格要求和限制，尤其是心脏病患者、对处方中的成分过敏者及正在服用任何形式硝酸盐类药物的患者禁止服用［2］。因此，该类药物必须在医生指导下服用。若脱离医生指导，长期过量食用含有该类物质的保健食品会存在健康风险，可能对心血管病患者带来潜在的危害，对服用者的健康和生命安全将造成威胁。但一些不法分子牟利心切，在中药保健品中大量添加有壮阳功能的非食用化学物质，对人体造成了很大危害。为规范市场秩序，国家食品药品监督管理局一面高压打击此类违法行为，另一方面不断发布非法添加物的相关补充检验方法，其中壮阳类非法添加物已补充检验方法涉及13种PDE－5 抑制剂［3－6］。然而不法生产者为了规避检查，在食品和保健食品中添加现行标准检测范围之外的其他类似物，如添加羟基红地那非［7］、二乙氨基前他达拉非［8－9］、2－羟乙基去甲基他达拉非［10－11］、甲羟基豪莫西地那非［12－13］等新型壮阳类非食用化学物质。这些衍生物与已经批准上市的PDE－5抑制剂药物具有相同的母核，结构差异小，几乎没有药理和毒理方面的研究信息，对公众健康构成了潜在的巨大威胁［14］。这些物质除了在保健酒、牡蛎粉等保健食品中添加外，还添加到茶叶、糖果、咖啡等食品中。层出不穷的新型衍生物，花样翻新的添加方式给监管和检验工作带来了严峻挑战。因此，有必要开展食品、保健食品中新型那非类衍生物检验方法的研究，加强对存疑产品的检查力度。

目前，检测保健品中非法添加物质的方法主要有薄层色谱法 （TLC）［15－16］、高效液相色谱法（HPLC）［17－18］及高效液相色谱－串联质谱法（HPLCMS/MS）［19－20］等。由于 TLC 法和 HPLC 法定性能力较弱，假阳性率较高，已逐步被灵敏度高、特异性强的HPLC－MS/MS法所取代［21］。HPLC－MS/MS法具有特异性好和灵敏度高的特点，集高效液相色谱法的高分离能力和质谱法的高灵敏度、高性能于一体，成为现代检测研究领域中强有力的分析工具之一，在打击非法添加行为方面发挥着重要的作用。我国目前执行的检验标准中均以液相色谱－质谱联用法检测食品、保健食品中非法添加壮阳类非食用化学物质，并以质谱检测结果作为判定依据。针对最新发现的一种新型他达拉非衍生物——2－羟基丙基去甲他达拉非（2－Hydroxypropyl nortadalafil），结构式如图1所示［22］，本实验采用HPLC－MS/MS法建立了多种食品基质中该物质的检测方法，为食品监管提供强有力的技术支持，使违法添加无所遁形，保障人民饮食用药安全。

图1 2－羟基丙基去甲他达拉非的结构

1 实验材料

1.1 仪器 Xevo TQ－XS型超高效液相色谱-串联质谱仪、Heraeus Multifuge X3R型高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；S180H型超声波清洗机（超声频率37 kHz，德国Elma公司）；ML204型分析天平（感重 0.0001 g，瑞士 Mettler－Toledo 公司）；Milli－Q超纯水器（美国Millipore公司）。

1.2 受试品与试剂 酒（每瓶500 ml）、牡蛎蛋白粉（每袋 3 g）、咖啡（每袋 2 g）、袋泡茶（每袋 15 g）、海参牡蛎颗粒（每粒 0.2 g）、金花牡蛎颗粒（每粒0.2 g）、海参牡蛎压片糖果（每片 0.5 g）、秋葵海参花片（每片500 mg）均为市售产品，随机购自网店及市内各超市药店；2－羟基丙基去甲他达拉非标准品（加拿大TLC药物标准品有限公司，纯度98.7%）；甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲醇（分析纯，广东光华化学有限公司）；实验用水为Milli－Q纯水仪制备的超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）；除特殊注明外，本方法所用试剂均为分析纯，所配制的溶液均为水溶液。

2 方法

2.1 标准溶液配制 精密称定2－羟基丙基去甲他达拉非标准品10.0 mg，用甲醇溶解并稀释至100 ml，摇匀，制成浓度为0.1 mg/ml的标准储备液，－20℃保存。准确吸取标准储备液0.5 ml，用甲醇稀释至10ml，摇匀，制成5μg/ml的标准品溶液，－20℃保存。精密移取该标准品溶液适量，加空白基质溶液稀释，制成浓度分别为 2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml的标准曲线溶液，临用新配。

2.2 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLCRHSST3（100 mm× 2.1 mm，1.8μm）；柱温：40℃；流动相：A为 0.1%甲酸水溶液，B为 0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.300 ml/min；进样量：1 μl；梯度洗脱方式：0 ～0.5 min，95%A；0.5 ～3.5 min，95% ～10%A；3.5～6.0min，10%A；6.0～6.1min，10%～95%A；6.1～9.0min，95%A。

2.3 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；雾化气：N2；碰撞气：He；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000L/h；锥孔反吹气流速：150L/h；锥孔电压：40.0V；撞能量：25 V；目标化合物保留时间：3.02 min，定量离子对（m/z）：434.1＞312.1，定性离子对（m/z）：434.1＞261.9 和 434.1＞168.9。

2.4 样品前处理方法

2.4.1 液体样品 取适量摇匀，精确吸取1.0 ml于50 ml容量瓶中，加入甲醇40 ml，超声提取10 min，放至室温，用甲醇定容至刻度，摇匀，用0.22μm有机相型滤膜过滤，取续滤液，根据实际浓度适当稀释至标准曲线线性范围内，备用。

2.4.2 固体样品 取适量样品粉碎混匀，称取1 g试样（精确至 0.001 g），置于 250 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声提取10 min，放至室温，再次称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，4 500 r/min离心5 min，用0.22μm有机相型滤膜过滤，取续滤液，根据实际浓度适当稀释至标准曲线线性范围内，备用。

3 结果与讨论

3.1 样品前处理方法优化

3.1.1 提取溶剂选择 实验考察了甲醇、50%甲醇溶液、乙腈等不同有机溶剂对阳性样品（目标物浓度：100 mg/kg）的提取效果，结果如表1所示。

表1 不同溶剂的提取效果

结果显示，50%甲醇溶液对该体系的提取效果较差，必须通过扩大溶剂量才能提高提取效果；而乙腈价格较为昂贵且提取效果不及甲醇，甲醇提取较为完全。通过采用50 ml、100 ml和200 ml体积甲醇反复提取，其提取率分别为 98.1%、99.5%、99.7%，考虑到溶剂消耗量问题，因此采用50 ml甲醇作为提取溶剂。

3.1.2 超声提取时间选择 实验还考察了不同超声提取时间（0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、40 min）对阳性样品（目标物浓度：100 mg/kg）的提取效果，提取率随时间变化关系如图2所示。

图2 2－羟基丙基去甲他达拉非提取率随时间变化曲线图

结果显示，采用超声提取方式可显著提高样品中目标物质的提取率，超声提取10 min后提取率基本稳定，因此采用超声提取样品10 min。

将所购样品的空白基质及溶剂按本方法进行分析，考察是否存在干扰。结果显示，空白基质基本无干扰，溶剂也无干扰，该方法特异性良好。

3.2 检测条件优化

3.2.1 液相色谱条件 那非类化学物质质谱电离模式一般为正离子模式，因此采用挥发性的甲酸来调节流动相pH值以提高离子化效率。以甲醇作为有机相时，目标化合物会出现双峰，积分时必须以双峰进行计算，易造成误判。乙腈作为有机相，目标化合物为单峰，既能缩短出峰时间也能减少基质干扰。实验考察了乙腈－水、乙腈－0.1%甲酸、0.1%乙腈－0.1%甲酸等流动相体系，目标峰在0.1%的甲酸水溶液条件下，峰形较好，质谱响应较高。为保持酸性平衡，在有机相中也添加了0.1%的甲酸。

为了提高待测物的分离效果和检测灵敏度，实验比较了HSST3、C18AQ、SB－C18三种不同性能C18色谱柱对待测物的分离和响应情况。结果表明，待测物在三种C18柱上均出峰，响应强度较稳定，其中HSST3柱为分析柱时，峰形较好，保留时间稳定，效果最佳。故本标准采用具有耐高压高强度的硅胶颗粒色谱柱HSST3柱为分析柱。由于保健食品多为复杂混合物，为保护色谱柱、提高分离效率，实验采用梯度洗脱模式。考察了多种梯度洗脱条件对待测物分离和响应值的影响，确定了2.2项中的梯度洗脱程序。

3.2.2 质谱条件 2－羟基丙基去甲他达拉非是以他达拉非为母核，以CH3CHOH－取代哌嗪二酮结构中甲基的H。在ESI（＋）源强电场作用下容易质子化，形成稳定的［M＋H］＋准分子离子峰。实验配制500 ng/ml的标准溶液用针泵连续直接进样，采用正离子模式，MRM多反应监测，分别对毛细管电压、离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、锥孔反吹气流速、锥孔电压、撞能量等质谱参数进行了优化，以确定化合物的母离子和子离子。实验选择离子丰度比最高且无干扰的离子作为定量离子，取另一个离子丰度较高、基线噪音低的离子作为定性离子对。标准溶液和阳性样品（目标物浓度：100 mg/kg）在实验条件下的MRM色谱图如图3所示。

图3 标准溶液（a）和阳性样品（b）的MRM色谱图

3.3 分析方法评价

3.3.1 线性回归方程和检出限试验 实验比较了不同基质在相同条件下基质加标曲线和甲醇溶剂配制曲线间的差异，采用以下公式计算基质效应（ME）：ME＝B/A×100%。其中式中B为基质标准曲线斜率，A为溶剂标准曲线斜率。

结果显示，目标待测物的ME值为62.3%～80.0%，二者存在不同基质中均有较大差异，说明检测方法存在较大基质效应，因此选择空白基质溶液配制标准曲线溶液。

以系列标准溶液进样，每个浓度进样3次。以各组分峰面积与浓度作线性回归，在质量浓度为2～200 ng/ml范围内线性关系良好，相关系数r＞0.999。在本实验条件下，将标曲浓度最低点溶液连续稀释，以信噪比（S/N）为3时的浓度作为该化合物的检出限，以信噪比（S/N）为10时的浓度作为定量限。2－羟基丙基去甲他达拉非的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限如表2所示。

表2 2-羟基丙基去甲他达拉非的线性回归方程、相关系数及检出限

3.3.2 回收率试验 准确吸取5μg/m l标准工作液0.02 ml、0.04 ml、0.2 ml，加入到空白基质中，按样品同法处理，最终定容至50 ml，各水平平行测定6次，回收率结果分析如表3所示。

表3 加样回收率试验（n＝6）

由表3可见，回收率范围在80.98%～113.97%内，相对标准偏差RSD为1.0%～4.8%。表明采用本法测定2－羟基丙基去甲他达拉非含量的回收率较高，使用本法检测结果可靠。

3.3.3 精密度试验 以标准曲线溶液（浓度为：2.0 ng/ml、4.0 ng/ml、20.0 ng/ml） 连续重复进样 6 次。同一样品三个水平平行测定6次的相对标准偏差RSD 分别为 1.5%、2.3%、2.0%，表明采用本方法测定2－羟基丙基去甲他达拉非含量的精密度较高，使用该方法所得检测结果准确可靠，重现性高。

3.4 样品测定 采用本法对40种宣称有抗疲劳功效的市售样品进行测定，每样品平行测定3次，取平均值。样品类型涉及酒、袋泡茶、牡蛎蛋白粉、保健颗粒片剂、咖啡、糖果等。其中3批次颗粒片剂、2批牡蛎蛋白粉和1批次糖果检出2－羟基丙基去甲他达拉非，占所有样品的比例为15%。其中，某颗粒片剂的含量高达每片70 mg，而他达拉非的推荐剂量仅为10 mg。本次检测结果显示，国内市场存在食品中非法添加2－羟基丙基去甲他达拉非的违法行为，且手段多样，用量巨大。因此，有必要加强对此类产品的检查力度，以保障人民饮食用药安全。

4 结论

本文建立了高效液相色谱－三重四极杆质谱测定牡蛎蛋白粉等食品、保健食品中非法添加化学物质2－羟基丙基去甲他达拉非的检测方法。以甲醇超声提取提高了提取率，选择耐高压的高强度HSST3柱提高了分离效率，选择0.1%乙腈－0.1%甲酸作为流动相，缩短了出峰时间，也减少了基质干扰。利用空白基质配制标准溶液来补偿和消除色谱分析中存在的基质效应，选择MRM模式增强了离子选择性、抗干扰能力和专属性。本方法简单、快捷、准确，所得检测结果满意。由于尚未有关于2－羟基丙基去甲他达拉非药理毒理活性数据的报道，无法预测其对人体健康的危害性。不法生产者将其添加到保健食品中，使消费者面临巨大的风险。为依法治国，建立健全我国食品、保健食品检验标准，迫切需要建立该类新型壮阳类非食用化学物质的准确检验方法，为食品安全监管提供强有力的技术保障。