李 杰 谢秀娟 宋 炜 潘维花 杨巍巍 于 顺*
(1.北京市大兴区中西医结合医院神经内科,北京 100076; 2. 首都医科大学宣武医院神经生物学研究室,北京 100053)
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是继阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)之后的第二大神经系统常见退行性疾病。目前基于运动症状的诊断已是PD发病的晚期,此时患者黑质多巴胺 (dopamine,DA)能神经元退变率已>70%[1]。但是,以路易体病变为主要特征的PD病理变化早在多巴胺能神经元病变之前就已经出现于嗅球、脊髓、消化道的壁内神经丛以及其他外周神经节中[2]。
路易体的主要成分是聚集的α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)。研究[3]显示,α-Syn在丝氨酸129(serine,S129)位点的磷酸化可致其发生聚集,形成寡聚化α-Syn。其中,蛋白磷酸酶2A (protein phosphatase 2A,PP2A)是导致其去磷酸化唯一的蛋白磷酸酶,而polo样激酶2(polo-like kinase 2,PLK2),则可以磷酸化α-Syn,并导致其毒性增加。神经酰胺是PP2A的激动剂,它的升高可间接促使磷酸化α-Syn去磷酸化。
研究[4-5]显示,α-Syn单体和寡聚体从神经元释放并存在于细胞外液,包括脑脊液和血浆中。体内和体外实验[6]均表明这些分子通过内吞作用被神经元内化。笔者假设,α-Syn的聚集和毒性很可能是由于PD患者内环境发生变化,而血液是构成机体内环境的重要组成部分。为了验证这个假设,本研究采用正常受试者(normal subject,NS)或PD患者的血浆培养大鼠原代神经元,评估α-Syn的磷酸化和其聚集与细胞活力的关系及机制。
选择PD患者和正常对照各28例。PD患者为2015年10月至2016年4月在首都医科大学附属北京天坛医院神经内科住院的PD患者,PD患者入选标准:有进行性发展的病史,存在2种以上PD的典型症状——静止性震颤、运动迟缓、僵直、姿势不稳,并排除其他原因造成的癌。患者平均年龄为(56.68±11.42)岁,所有入选者均签订知情同意书。正常对照选择年龄、性别与之匹配的健康正常人。
1.2.1 试剂
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记山羊抗小鼠IgG多克隆抗体购自中杉金桥公司;生物素化的3D5由康为世纪公司标记;3D5抗α-Syn的单克隆抗体为本实验室制备;抗S129位磷酸化α-Syn多克隆抗体(Santa Cruz公司,美国)Neurobasal培养基(Gibco公司,美国),B27 (Gibco公司,美国),Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)培养基(Gibco公司,美国),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Berlin公司,美国)。BCA蛋白质定量试剂盒(Pierce Biotech公司,美国)。
1.2.2 实验动物
健康Vista大鼠,鼠龄0~12 h,由中国军事医学科学院动物中心提供,实验动物许可证号:SCXK-2017-005。
1.2.3 重组人α-Syn的制备和纯化
将含有α-Syn基因的pET重组质粒转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,在含氨苄西林的2×YTA培养液中培养至适当密度后加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导蛋白表达3 h,超声破碎,进一步用离子交换层析、疏水层析及反相层析纯化后获得α-Syn蛋白。纯化后的α-Syn蛋白经BCA法定量和Western blotting法鉴定后,冷冻抽干于-80 ℃分装保存。
1.2.4 海马神经元原代培养
冰上断头去除Vista大鼠双侧海马,剪碎后用0.25%(质量分数)胰蛋白酶37 ℃消化30 min,用DMEM培养基[90%(体积分数) DMEM + 10%(体积分数)胎牛血清]终止消化。巴斯德玻璃滴管火焰抛光后,轻柔吹打。用DMEM培养基稀释成5×105/mm3的密度接种到直径35 mm多聚赖氨酸包被的培养皿,置于37 ℃,5%(体积分数)CO2的培养箱内。2 h后,显微镜下观察神经元贴壁后,改用Neurobasal、B27无血清培养基继续培养箱内培养。以后每3 d换液1次,培养10~12 d左右用于实验。
1.2.5 PD患者血浆细胞外α-Syn孵育方法
终浓度100 μmol/L α-Syn,溶于含30%(体积分数) PD血浆或正常人血浆的PBS缓冲液中,37 ℃,1 000 r/min,震荡孵育48 h。利用亲和层析纯化α-Syn寡聚体,在原代神经培养基中加入终浓度为5 μmol/L的α-Syn单体及寡聚体,同时添加30%(体积分数)PD血浆、正常人血浆和胎牛血浆,37 ℃,孵育14 d。
1.2.6 Western blotting法检测α-Syn磷酸化和寡聚化
抽提各组原代神经元,选用放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay,RIPA)蛋白裂解液进行细胞裂解,BCA法测蛋白浓度,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE),半湿转法将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)PVDF膜,5%(质量分数)脱脂奶粉封闭1 h,分别入3D5 (1∶5 000);或anti-S129-pS-α-Syn兔多抗 (1∶2 000)。4 ℃过夜。0.1%(质量分数) TBST洗膜3次,入相应的HRP标记的羊抗兔(或鼠)免疫球蛋白抗体中(1∶5 000)室温孵育1 h,洗膜同前。加入化学发光液,于暗室化学发光及显影、定影。
1.2.7 酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测α-Syn寡聚化和磷酸化 参考文献[7]已经建立的ELISA方法进行测试。用浓度为1 mg/L的3D5或者磷酸化α-Syn抗体包被96孔酶标板,2.5%(质量分数)明胶封闭2 h。加入震荡后的α-Syn,37 ℃孵育2 h。向各孔加入100 μL碱性磷酸酶标记的亲和素(1∶5 000),37 ℃孵育1 h。以上每一步骤之后用PBST洗涤各孔4次。最后加入100 μL对硝基酚磷酸显色液(p-nitrophenol,pNPP),37 ℃显色30 min,405 nm处测定吸光度值。
1.2.8 流式细胞技术
在25 cm2小培养瓶中培养的各组原代神经元,经过寡聚体样品处理14 d后,弃去培养基,以0.25%(质量分数)胰酶消化悬浮;2 000 r/min,离心5 min收集细胞。预冷PBS洗涤细胞两次;用400 μL Binding Buffer悬浮细胞,调整细胞浓度约为1×106个/mL。在细胞悬浮液中加入5 μL Annexin V-异硫氰酸荧光素,(fluorescein isothiocyanate,FITC),混匀后于4 ℃避光下孵育15 min。加入10 μL 碘化丙啶(propidium iodide,PI)后轻轻混匀于4 ℃避光孵育5 min;1 h内以FACSCalibur流式细胞仪分析检测。
1.2.9 α-Syn细胞活性检测
3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]法检测各组细胞活性,各组细胞按1×105个/孔接种于96孔板,每组8个孔,每孔加入20 μL 5 g/L MTT。放入5% (体积分数)CO2培养箱中孵育4 h后,每孔加入100 μL 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),混匀,490 nm波长处测定吸光度值。
Western blotting法检测结果显示各组均出现不同程度的α-Syn寡聚体,相对分子质量分别是36 000、54 000、72 000、108 000和254 000;对照组无磷酸化α-Syn检出,NS组和PD组磷酸化α-Syn寡聚体,多为54 000。Western blotting法和ELISA法检测结果显示,PD组的寡聚体和磷酸化均α-Syn较NS组明显升高。与正常人血浆相比,PD血浆能够促进α-Syn磷酸化和寡聚化(图1)。
图1 PD血浆可促进α-Syn发生寡聚化和磷酸化Fig.1 Effects of NS and PD plasma on α-Syn oligomerization and phosphorylation in neuronal culture medium
A: Oligomeric α-Syn levels were examined by Western blotting;B: pS-α-Syn levels were examined by Western blotting;C: Oligomeric α-Syn levels were examined by ELISA;D: pS-α-Syn levels were examined by ELISA. (n=5). Recombinant human α-Syn (5 μmol/L) was added to medium containing 30% NS or PD plasma for 14 days.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vsCTL;PD(1-3): plasma of Parkinson’s disease (3 cases);α-Syn: α-synuclein;pS-α-syn: phosphorylation S129 α-synuclein;CTL: Control group;NS(1-3): palsma of normal sample (3 cases);ELISA:enzyme linked immunosorbent assay.
MTT法检测显示,加入PD患者血浆孵育的α-Syn寡聚体组(o-α-Syn-PD)细胞活力比对照组明显降低;比正常人血浆孵育的寡聚体(o-α-Syn-NS)组的细胞活力低约30%(图2)。向原代神经元培养基中添加o-α-Syn-PD,培养至第1、3、5、7和14天,MTT法观察细胞活力变化,结果显示o-α-Syn-PD组的细胞活力随培养时间增加而降低(图3 A)。向原代神经元培养基分别添加终浓度为1、2、4、8、10 mmol/L的寡聚体,培养14 d,寡聚体组的细胞活力均随剂量的增加而降低(图3 B)。流式细胞术结果显示PD组总凋亡细胞数比对照组多约14.3%,比正常人组多约7.6%(图4)。
o-α-Syn-PD组PP2A的活力较对照组和正常人血浆组降低(图5 A),培养时间越长(1~14 d),PP2A活力下降越明显(图5 B),且随寡聚体浓度(1~10 mmol/L)的增加而下降,具有明显的剂量-效应关系(图5 C)。Western blotting法检测结果显示,PD组神经元内的PP2A的表达水平并未异常,而C亚基酪氨酸307位磷酸化PP2A含量增加(图5D ),这一变化是PP2A活力下降的主要原因。加入C2-ceramide后,PP2A的活力回复正常(图5E)。
图2 MTT法检测PD血浆孵育的α-Syn寡聚体引起原代神经元细胞活力下降Fig.2 Cell viability decreased in the neurons after treated with o-α-Syn-PD
*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vso-α-Syn-NS group.PD: plasma of Parkinson’s disease;o-α-Syn-PD: oligomer-α-synuclein incubated in Parkinson’s disease plasma;o-α-Syn-NS: oligomer-α-synuclein incubated in normal subject plasma;m-α-Syn: monomer-α-Syn.
帕金森病是一种常见的慢性、进行性神经变性疾病。主要的病理特征是中脑黑质致密带DA能神经元选择性、进行性变性,纹状体中DA含量明显减少,残余的神经元内出现嗜酸性包涵体、路易小体,主要成分是α-Syn。α-Syn的多种结构形式如无定型聚集物“寡聚体”原纤维,及其磷酸化、硝基化和泛素化均有神经毒性作用。这些错误折叠、寡聚化α-Syn和α-Syn在神经元胞质内呈动态平衡,当平衡改变后,可溶性原纤维迅速聚集成大分子、不溶性细纤维进而形成Lewy小体[8]。
图3 o-α-Syn-PD 对神经元活力下降的效应具有剂量和时间依赖关系Fig.3 Dose and time dependence o-α-Syn-PD deceased the neural cell viability
A: Time-dependent decrease in cell viability in primary cultured neurons treated by o-α-Syn-PD. o-α-Syn-PD were added to neurons at 5 μmol/L for DIV 14. The oligomer began to influence the cell viability from 3d after addition and the call viability lower with cultured time.n=12.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vso-α-Syn-NS group;B:effect of o-α-Syn-PD decrease the cell viability appeared dose-dependent relation;o-α-Syn-PD: oligomer-α-synuclein incubated in Parkinson’s disease plasma;o-α-Syn-NS: oligomer-α-synuclein incubated in normal subject plasma.
图4 流式细胞术检测结果Fig.4 Results of flow cytochemistry
A: Rate of apoptosis neurons in o-α-Syn-PD group was significantly increased compared with the control group, and higher than in o-α-Syn-NS by about 14.3%;B: representative images of flow cytometry in each group.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vso-α-Syn-NS group;o-α-Syn-PD: oligomer-α-synuclein incubated in Parkinson’s disease plasma;o-α-Syn-NS: oligomer-α-synuclein incubated in normal subject plasma;m-α-Syn: monomer-α-Syn;FITC:fluorescein isothiocyanate;PI:propidium iodide.
可溶性神经毒性作用的α-Syn聚集,暂时可避免神经元受到更广泛的损害,而最终病理性积聚导致细胞的凋亡或退行性死亡。笔者认为,作为一种广泛累及的全身性疾病,PD患者血液环境可能成为改变细胞外α-Syn正常构象的重要场所和影响因素,并成为α-Syn病理的传播途径之一,加速PD的病程进展。
PD的机制研究中,影响α-Syn蛋白构型寡聚化的因素有很多,其中以磷酸化修饰受到的关注最多。α-Syn第129位丝氨酸磷酸化是PD的一个重要特征。并且在PD患者的LB中,90%的o-α-Syn的129位丝氨酸发生了磷酸化的异常修饰[9-10]。体外实验显示S129磷酸化后比未磷酸化能产生更多寡聚体和不溶性成分。该磷酸化主要由PLK2完成、一系列相关酶如PP2A等的调节,通过N末端的重复序列或NAC区为底物,磷酸化率>95%。
本研究在37 ℃、1 000 r/min震荡的条件下,将α-Syn在血浆中孵育48 h。利用偶联有α-Syn单克隆抗体的CNBr活化的琼脂糖凝胶4B作为介质,亲和层析法将PD血浆中孵育的α-Syn寡聚体纯化出来。通过Western blotting法及ELISA法分析,证实经PD患者周围血浆孵育,α-Syn会发生与在神经元内相似的S129位点的磷酸化修饰,这意味着,PD患者的周围血浆环境存在对α-Syn进行S129磷酸化的修饰,从而打破构象平衡而出现聚集。
PP2A是α-Syn去磷酸化的唯一蛋白磷酸酶,其减少可以引起α-Syn磷酸化水平升高,且α-Syn过表达或寡聚化,可使PP2A催化亚基酪氨酸307位点发生磷酸化,降低活性,并进一步致α-Syn磷酸化水平升高发生聚集,形成恶性循环[11]。外周血中可溶性α-Syn寡聚体可以通过血-脑脊液屏障进入脑内,并对神经元产生毒性。本研究通过Western blotting法和ELISA法证实,随着α-Syn寡聚体浓度升高和作用时间的增加,可引起细胞内的PP2A发生磷酸化水平增高和活力降低。在培养中给予神经酰胺,可使PP2A的活力升高,神经元活力也随之升高。而PD患者血浆孵育的α-Syn寡聚体,和正常人相比,引起的PP2A等酶活性下降更明显。本研究中所得出的结论与文献[11]一致,这说明当PD中枢神经系统内出现病变以后,相关酶的变化可在外周血液环境中发生同步变化,而外周血液中与α-Syn磷酸化相关酶类活性的改变、导致了α-Syn磷酸化修饰水平,并促使其聚集。本实验结果表明,细胞外α-Syn主要是以129位丝氨酸磷酸化修饰为主,在等量的α-Syn寡聚体中,PD血浆孵育的α-Syn寡聚体磷酸化水平要比正常人显著升高。这样的α-Syn寡聚体可由神经元培养基中,进入神经元内部,引起神经元活力的下降和死亡。
图5 PD血浆孵育寡聚体降低细胞内PP2A活性Fig.5 Effect of o-α-Syn-PD on PP2A activity
A:PP2A activity in neurons decreased by o-α-Syn-PD;B:Time-dependent decrease in PP2A activity in primary cultured neurons treated by o-α-Syn-PD;C: effect of o-α-Syn-PD decrease the PP2A activity appeared dose-dependent relation;D: Co-IP with Western blotting result showed that the protein level of PP2A in neurons treated with oligomers for 14 days is no difference with control group, the Tyr307 phosphorated PP2A increased compared with control group and o-α-Syn-NS group;E: C2-ceramide prevented the PP2A activity downregulation induced by o-α-Syn-PD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vso-α-Syn-NS group;△P<0.01vso-α-Syn-PD +C2-ceramide group;o-α-Syn-PD: oligomer-α-synuclein incubated in Parkinson’s disease plasma;o-α-Syn-NS: oligomer-α-synuclein incubated in normal subject plasma;m-α-Syn: monomer-α-Syn;PP2A: protein phosphatase 2A.
这样的具有神经毒性的α-Syn聚集体,在周围血液中发生修饰形成对机体影响重大。因为尽管α-Syn可形成外泌体由细胞以胞吐形式分泌[12],或以寡聚体的形式存在,但细胞外游离的α-Syn单体仍占大多数。这些占大多数的α-Syn发生异常聚集后,会随着血液传播。并透过血-脑脊液屏障返回神经系统加剧对中枢神经系统的损伤。
笔者认为PD患者血浆环境的变化,及其对PD关键蛋白α-Syn磷酸化和寡聚化的修饰,很可能是Lewy体病变全身累及的关键因素。在血液中的α-Syn的寡聚体会随血液循环累及周围神经,造成内脏自主神经、脊髓和低位脑干、嗅束嗅球等部位受损时,出现早期的非运动症状,如便秘、体位性低血压、嗅觉减退等;而此时脑内神经元尚处于代偿状态。随着病程的进展,周围血液孵育的α-Syn寡聚体不断通过血-脑脊液屏障进入中枢神经系统,中枢神经元损伤的程度加剧,当路易体病变蔓延到海马和皮质等部位时则引起认知功能下降、累及至中脑黑质、纹状体等引起运动障碍,并随着病程的进展而发展。
综上,基因突变等原因导致的α-Syn的过表达,线粒体损伤,使得细胞内环境发生变化,α-Syn出现磷酸化水平增加,易于发生磷酸化并聚集。α-Syn寡聚体在生理环境下较稳定,不易分解,并可以进一步使胞内PP2A的活力下降,加速α-Syn的磷酸化和寡聚化。随着病程的进展,部分死亡的神经元分解后,释放Syn单体和磷酸化的α-Syn寡聚体进入血液中。受脑组织的释放减少以及在血液中的α-Syn寡聚体的影响,血中PP2A活性下降。血液中的α-Syn的单体磷酸化水平增高并易于聚集。已聚集的α-Syn进一步降低PP2A的活性,并加速寡聚体的形成。在血液中孵育的α-Syn寡聚体的再次进入神经元内,一方面会直接破坏细胞稳定性,另一方面抑制PP2A的活性,同时使神经元内的α-Syn修饰环境恶化,进一步加速α-Syn的磷酸化和寡聚化,这一可能是PD病程快速进展的重要机制。