端粒重复序列结合因子1和2在口腔黏膜癌组织中的表达及临床意义

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口腔黏膜癌是指发生于口腔黏膜的鳞状细胞癌，约占口腔恶性肿瘤的90%，临床治疗以手术和放疗为主，但因其具有高转移率和高复发率的特点，这些治疗手段并不十分理想[1-2]。目前国内外关于口腔黏膜癌发病的分子机制研究较多，其中一个重要机制与端粒功能失调密切相关[3]。端粒是细胞内染色体末端维持染色体结构完整性的重要结构，其功能失调与许多癌症的发生、发展有着密切的关系[4]。端粒重复序列结合因子(telomere repeat binding factor,TRF)1与TRF2是当前医学生物学研究领域的热点之一。许多研究表明TRF1与TRF2是端粒双链DNA 2种重要的结合蛋白，TRF1对端粒长度具有负调控作用，而TRF2则参与维持端粒结构的完整性与维持基因组的稳定性[5-7]。本研究通过检测正常组织、癌旁组织和肿瘤组织中TRF1、TRF2蛋白表达水平的变化，探讨TRF1、TRF2蛋白表达与口腔黏膜癌病变的关系，为临床治疗提供相关参考依据。

1 资料和方法

1.1 临床资料 收集2012年7月—2016年7月武汉大学人民医院收治的48例口腔黏膜癌患者癌组织和癌旁组织(距病灶1～2 cm)标本，其中男性33例，女性15例;年龄42～75(53.6±4.9)岁。所有病例均经手术病理检查证实为口腔黏膜癌。所有患者研究前均未接受放疗与化疗等相关治疗，具备完整的临床病理资料，并签署研究知情同意书。根据肿瘤细胞的分化程度将组织块分为高分化组13例，中分化组19例和低分化组16例。此外选择32例正常口腔软组织块标本作为正常对照组。上述所有标本经过4%多聚甲醛固定，行石蜡包埋、切片(3～4 μm)，分别进行苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色与免疫组化分析。

1.2 免疫组化 一抗:TRF1、TRF2抗体均为美国Santa Cruze Biotechnology公司产品；二抗：免疫组织化学SP试剂盒购自福建迈新生物技术公司。严格按照试剂盒说明书中步骤进行免疫组织化学染色。以磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定 免疫组化结果按参考文献[8]进行判定：TRF1与TRF2的阳性反应表现为细胞核或细胞浆呈现棕黄色或更深颜色颗粒。切片的阳性细胞数采用3分制计分：切片未见染色，为阴性，计0分；轻度染色计1分；中度染色计2分；深度染色计3分。另外，阳性细胞率仍采用3分制：无阳性细胞计0分；阳性细胞<20%计1分；阳性细胞在20%～50%间计2分；阳性细胞>50%计3分。将阳性细胞数及阳性细胞率所得评分相乘得到免疫组织化学评分。阴性为0～3分；弱阳性(+)4～5分；中度阳性(++)6～7分；强阳性(+++)8～9分。

1.4 统计学处理 应用SPSS 22.0软件进行处理分析。计数资料采用χ2检验进行统计分析，以P<0.05为差异比较有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果及TRF1、TRF2在不同组织中的表达情况 HE染色结果表明，口腔黏膜正常组织细胞增殖缓慢(图1A)，而在口腔黏膜癌组织则发现大量的癌细胞密集聚集(图1B)。免疫组化结果显示，TRF1蛋白主要定位于细胞浆，在癌组织中的表达明显低于正常组织(图1C、图1D)。TRF2蛋白则在细胞浆和细胞核有不同程度表达，但在癌细胞中主要集中于细胞核。从表1可见，在癌组织中TRF1阳性率显著低于癌旁组织和正常组织(χ2=6.147，P=0.007)；而在癌旁组织与正常组织间差异比较无统计学意义(χ2=4.775，P=0.065)。TRF2阳性率在癌组织中显著高于癌旁组织和正常组织(χ2=20.003，P=0.007)，而在癌旁组织与正常组织间差异比较无统计学意义(χ2=8.054，P=0.059)。

A：口腔黏膜正常组织HE染色结果；B：癌组织HE染色结果；C：癌组织中TRF1免疫组化结果；D：口腔黏膜正常组织中TRF1免疫组化结果图1 HE染色及免疫组化染色结果

蛋白组织类型-++++++总阳性率(%)口腔黏膜癌组织21518456.20∗ TRF1癌旁组织161013966.67正常口腔软组织4581587.50口腔黏膜癌组织98131881.25∗TRF2癌旁组织25414547.92正常口腔软组织2145234.38

注：*与正常口腔软组织和癌旁组织组比较，P<0.01

2.2 TRF1与TRF2在不同病理分级中的表达情况 TRF1在高分化与中分化癌组织中的阳性率均显著高于低分化组织(P<0.05)，而TRF2高分化与中分化癌组织中的阳性率均显著低于低分化组织(P<0.05)，表2。

表2 TRF1与TRF2在不同病理分级中的表达

注：*与低分化组比较，P<0.05

3 讨论

口腔黏膜癌又称口腔癌，是发生于口腔黏膜的鳞状细胞癌，是常见的的恶性肿瘤之一。尽管其发病原因尚未明确，以往研究发现吸烟、饮酒，嚼槟榔等可能是主要危险因素[9]。口腔癌细胞与身体其他部位鳞癌相似，常浸润周围组织，有早期广泛淋巴结转移的倾向。WHO根据肿瘤恶性程度，将口腔鳞癌分为高、中、低分化三级[10]。

端粒是真核生物线性染色体末端的核酸蛋白复合物,在基因组完整性的保持中起主要作用,端粒功能的改变可能直接影响细胞和生物体的癌症易感性。TRF1是端粒双链DNA结合蛋白之一，具有多种重要的生物学功能。它是端粒长度的负调控因子，它能够以二聚体的形式与端粒DNA结合，使端粒酶无法接近端粒末端发挥作用,从而缩短端粒长度[11]。研究发现，过表达TRF1能使较短端粒的细胞进入有丝分裂并诱导其凋亡[12]。TRF2是与TRF1同源的蛋白，在维持端粒长度、结构和保护染色体末端方面同样发挥重要作用。研究表明，只有保持TRF2蛋白在一定水平，才能和其他端粒蛋白一起维持端粒结构的完整性以及基因组的稳定性[13]。在恶性肿瘤形成的早期,端粒错误融合,形成双着丝粒染色体,发生断裂融合桥循环,基因的快速重组使得极少数发生相关改变的细胞能成为癌细胞。

本研究发现,口腔癌组织中的TRF1表达水平较癌旁组织和正常组织显著降低，而TRF2表达水平却比癌旁组织和正常组织明显升高。其他学者对相同部位以及身体其他部位鳞癌组织中端粒结合蛋白表达的研究结果尚未完全一致[14-16]。从TRF1和TRF2在调节端粒长度和细胞分裂的功能来看，TRF1表达水平降低意味着上皮细胞端粒酶功能的激活与增强，细胞凋亡的调节能力减弱，细胞周期延长[17]。而且本研究发现TRF1在低分化的癌旁组织表达也比中、高分化的癌旁组织表达更低，可以进一步证实对细胞癌变的影响。与TRF1表达变化正好相反，TRF2在肿瘤组织中表达水平明显升高，但究竟是TRF2表达的异常升高影响端粒融合，还是受到基因错误重组的反馈调节还存在争议。另外本研究也发现，TRF2在癌旁组织和正常组织细胞中胞核与胞浆中均有表达，而癌变细胞中却主要集中在细胞核内，可以推测TRF2的过表达与在细胞核集中有着一定的功能上的关联，值得进一步研究。综上所述,TRF1、TRF2蛋白表达水平与口腔黏膜癌的发生、发展可能具有密切相关性。