REGγ基因异常表达与甲状腺乳头状癌发生、发展相关性分析

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REGγ基因属REG/11S蛋白酶体激活因子家族成员，也被称为PSME3或PA28γ，可结合并激活20S蛋白酶体，以非泛素或非ATP依赖方式促进类固醇受体辅助活化因子-3、p21、p16等靶蛋白降解[1]。REGγ基因在结肠癌、肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤组织中高表达，或有转移抑制作用[2-3]，但针对其在甲状腺癌中表达的研究国内相对鲜见。本研究分别检测REGγ基因在正常甲状腺组织、甲状腺良性病变组织及甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)组织中的表达情况，分析REGγ基因异常表达与PTC发生、发展的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料 经患者知情同意，签署知情同意书。收集2015年1月—2018年6月成都市第二人民医院手术切除甲状腺标本103例，经临床病理明确诊断，其中PTC 59例，未分化癌(undifferentiated carcinoma，UTC)6例，滤泡癌(follicular carcinoma，FTC)4例，滤泡性腺瘤(follicular adenoma，FA)19例，结节性甲状腺肿(nodular goiter，NG)15例；男性患者32例，女性患者71例；年龄20～74岁，中位年龄45岁。PTC患者肿瘤直径<2 cm者46例，≥2 cm者13例，伴淋巴结转移21例。距病灶2 cm处取癌旁组织14例作为正常对照。部分标本离体30 min内置于-80 ℃超低温冰箱中保存，剩余组织经10%中性福尔马林缓冲液固定，石蜡包埋切片。

1.2 实时定量-PCR(real-time PCR，RT-PCR)法检测REGγ mRNA表达 ①根据TRIzol试剂盒(美国Gibco-BRL公司)说明书提取总RNA，分析纯度、含量，逆转录合成cDNA。使用Primer 5软件设计REGγ引物，以5′-GCCTGTATCAAAGTCACCAAA-3′为上游引物，5′-CAGGAGCAGGAAAGCAAAG-3′为下游引物，产物273 bp。每份标本以β-actin为内参对照，以5′-CTCATTGCCAATGGTGST-3′为上游引物，5′-ACCGAGCGCGGCTACAGC-3′为下游引物，产物170 bp。引物均由深圳华大基因公司设计完成。同管扩增，总反应体系12.5 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s，共32个循环；72 ℃再延伸5 min；4 ℃保存。②取10 μL PCR扩增产物，1.5%琼脂糖凝胶电泳；置紫外灯下拍照行面积灰度扫描，将密度表示其表达量；计算目的基因RT-PCR产物光密度容积与β-actin基因RT-PCR产物光密度容积的比值，将其作为目的基因mRNA的相对含量。③使用3100型全自动遗传分析仪测定PCR产物序列，并通过Blast程序将结果与GenBank数据库序列进行同源性比较。

1.3 免疫组化检测REGγ蛋白表达 ①参照试剂操作说明书，使用EnVision两步法用乙二胺四乙酸缓冲液微波抗原修复11 min。采用扁桃体作为已知阳性组织切片做阳性对照，采用磷酸缓冲盐溶液代替一抗做阴性对照。抗体及EnVision试剂盒均购自上海长嘉生物技术有限公司，DAB显色液购自福州迈新生物技术开发有限公司。②结果判定：REGγ蛋白定位于细胞浆，呈棕黄至棕褐色染色为阳性细胞。采用网格计数法判定，随机选取10个不重复视野，400倍光学显微镜下观察免疫组化染色的阳性蛋白表达。染色强度评分：无着色计0分，淡黄色染色计1分，棕黄色染色计2分，棕褐色染色计3分。阳性细胞评分：细胞阳性率<5%计0分，细胞阳性率5%～25%计1分，细胞阳性率26%～50%计2分，细胞阳性率51%～75%计3分，细胞阳性率>75%计4分。以染色强度评分+阳性细胞评分判定染色分级，阳性为≥3分，阴性为<3分。

2 结果

2.1 总RNA鉴定 提取总RNA光密度(optical density,OD)260/280值为1.8～2.0，提示RNA提取纯度较高，可满足RT-PCR试验要求。1%琼脂糖电泳可观察到2条清晰的亮带(28 s、18 s)，提示RNA完整未降解。

2.2 RT-PCR检测 β-actin内参基因片段长度170 bp，REGγ目的基因片段长度273 bp(图1)；PTC组织中REGγ mRNA表达水平显著高于FA、NG及癌旁正常甲状腺组织，差异比较具有统计学意义(t分别为6.503，4.119，5.520，P<0.05)；PTC组织中REGγ mRNA表达水平与UTC、FTC组织比较，差异比较无统计学意义(t分别为0.630，0.352，P>0.05)；不同年龄、性别患者REGγ mRNA表达水平比较，差异比较无统计学意义(P>0.05)；肿瘤直径<2 cm患者REGγ mRNA表达水平显著高于肿瘤直径≥2 cm患者，无淋巴结转移患者REGγ mRNA表达水平显著高于淋巴结转移患者，差异比较有统计学意义(P<0.05，表1)。

1：阴性对照；2：癌旁正常甲状腺组织；3，4：FA；5，6：PTC；M：DNA标记图1 RT-PCR法检测REGγ mRNA表达

参数nREGγ mRNAREGγ蛋白阳性[n(%)]组织类型 PTC593.58±1.6039(66.10) UTC63.16±0.922(33.33) FTC43.29±1.482(50.00) FA191.07±0.894(21.05) NG151.84±0.610(0.00)癌旁正常甲状腺组织141.18±0.510(0.00)临床病理特征 年龄(岁)<45413.70±1.5629(70.73)≥45183.35±1.4410(55.56) 性别男性173.73±1.048(47.06)女性423.59±1.5128(66.67) 肿瘤直径(cm)<2464.05±0.9537(80.43)≥2132.99±0.484(30.77) 淋巴结转移有212.94±1.299(42.86)无384.22±1.4334(89.47)

2.3 免疫组化 REGγ蛋白在癌旁正常甲状腺组织中少量表达，主要表达在滤泡上皮细胞的胞浆；癌组织内可见肿瘤细胞胞浆阳性着色；不同PTC病例呈不同程度异常表达(图2)。PTC组织中REGγ蛋白阳性率为66.10%，高于UTC(33.33%)及FTC(50.00%)，但组间比较差异比较无统计学意义(χ2=2.511，0.427，P>0.05)；FA组织中REGγ蛋白阳性率为21.05%，NG及癌旁正常甲状腺组织REGγ蛋白均为阴性表达，与PTC组织比较差异具有统计学意义(χ2=11.791，20.964，19.869，P<0.05)；不同年龄、性别患者REGγ蛋白阳性率比较，差异比较无统计学意义(P>0.05)；肿瘤直径<2 cm患者REGγ蛋白阳性率显著高于肿瘤直径≥2 cm患者，无淋巴结转移患者REGγ蛋白阳性率显著高于淋巴结转移患者，差异比较具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

A：PTC患者REGγ蛋白阳性表达；B：PTC患者REGγ蛋白阴性表达；C：癌旁正常甲状腺组织REGγ蛋白阴性表达图2 PTC患者REGγ蛋白表达(EnVision×200)

2.4 REGγ mRNA与蛋白表达的关系 Spearman相关性分析显示，PTC组织中REGγ mRNA与蛋白表达呈正相关关系(r=0.504，P<0.05)(图3)。

图3 REGγ mRNA与蛋白表达的相关性

3 讨论

随着人们生活方式的改变，癌症已上升至人类全部死因的第二位，肺癌、大肠癌、肝癌等恶性肿瘤已成为威胁患者生命的主要疾病[4-5]。目前，对于这些疾病尚无十分有效的治疗手段，因此急需了解其发病机制，寻找新的药物靶点，开发新型药物。REGγ是一种蛋白酶体激活因子，在细胞周期和肿瘤发生、发展的调控中起重要作用。目前研究发现REGγ基因在结肠癌、肝癌、肺癌中均有过表达，且与肿瘤的发生、发展密切相关[6]。然而，对REGγ基因在PTC中的表达水平以及表达调控机制尚不清楚。

REGγ-蛋白酶体属REG/11S家族蛋白酶体激活因子，可结合并激活20S蛋白酶体，与19S激活因子-蛋白酶体以泛素和ATP依赖的经典方式降解蛋白底物[7-8]。而REGγ-蛋白酶体降解蛋白质底物却并不需底物泛素化或ATP[9]。REGγ最初是在系统性红斑狼疮患者血清中发现，其蛋白降解功能一直受到临床关注，并形成了经典的观点，认为REGγ仅降解短肽片段，不能降解胞内完整的蛋白[10-11]。但近年来Li等[12]研究推翻了这一观点，其研究认为REGγ-蛋白酶体可降解与体内多种肿瘤形成密切相关的类固醇受体辅助活化因子-3(SRC-3)。随后Mao等[13]研究者相继发现若干REGγ重要靶点(p53、p21、p16、p19)，进一步证实了REGγ的生物功能多样性和重要性。Barton等[14]最近研究发现，REGγ缺陷小鼠因特异有丝分裂缺陷而体型消瘦，在果蝇内发现REGγ对细胞分裂的效应[15]，由此认为REGγ是细胞周期进程和细胞生存的重要调节因子，是致癌潜力的重要调节机制，对肿瘤的发生、发展起重要作用。本研究调查PTC病理组织中REG的表达，获得REG在癌旁正常组织及肿瘤组织中的差异性表达信息，了解REG与PTC发生、发展的关系，揭示REG异常表达的调控机制，结果显示PTC组织中REGγ mRNA表达水平为(3.58±1.60)，显著高于FA、NG及癌旁正常甲状腺组织，提示REGγ在PTC中表达上调。

免疫组化结果显示REGγ蛋白在FA中的表达介于PTC与正常甲状腺组织之间的过渡性改变；PTC组织REGγ蛋白表达阳性的病例癌旁正常甲状腺组织REGγ蛋白均为阴性。进一步行Spearman相关性分析发现PTC组织中REGγ mRNA与蛋白表达呈正相关关系。以上结果提示REGγ基因表达与PTC发生、发展相关，其表达水平上调可能是PTC病情进展的早期表现。

综上所述，REGγ基因表达可能与PTC发生、发展密切相关，或可将REGγ表达水平上调作为评价肿瘤恶性程度、转移情况及预后评估的参考指标；PTC患者REGγ mRNA表达与REGγ蛋白水平的总体趋势一致，可认为REGγ蛋白增加多依赖mRNA合成增加，但REGγ基因表达异常可能涉及基因转录等多个层面，其具体机制还有待进一步研究探讨。