人源丁酸梭菌TK520的筛选及其特性研究

杨 帆 王海宽 刘学勤 刘于小雪

1（鄂尔多斯生态环境职业学院，内蒙古鄂尔多斯017010）

2（天津科技大学生物工程学院，天津300457）

丁酸梭菌（Clostridium butyricum） 又称酪酸梭状芽胞杆菌，是人类肠道菌群的成员之一，是一种安全、有效的益生菌。丁酸梭菌最初从人类粪便和土壤中筛出，其体外发酵产生短链脂肪酸（SCFA），在胃肠道中具有刺激肠道蠕动，促进有益细菌生长，改善肠道微环境等作用。人源益生菌是一类来源于人体且能调节人体肠道内微生态平衡的菌群，具有很高的安全性和遗传稳定性，不易被生物体肠道的免疫系统排斥，适合作动物益生菌。本研究从健康人体粪便中筛选人源性产丁酸细菌，其中从一名健康女性的粪便中筛选出一株耐氧性的丁酸梭菌TK520，并对该菌进行生理特性测定。

1 材料与方法

1.1 培养基与试剂

脑心浸液（BHI）培养基（g/L）：胰蛋白胨10.0 g，牛心浸粉17.5 g，氯化钠5.0g，葡萄糖2.0 g，磷酸氢二钾2.5 g，水1000 mL，pH 7.4；强化梭菌（RCM） 培养基 （g/L）：蛋白胨 10.0 g，牛肉粉10.0 g，酵母粉3.0 g，葡萄糖5.0 g，可溶性淀粉1.0 g，氯化钠5.0 g，醋酸钠3.0 g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g，琼脂0.5 g，水1 000 mL，pH 6.8；低聚葡萄糖培养基（g/L）：低聚葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，K2HPO45 g，MgSO40.2 g，MnSO40.2 g，水 1 000 mL，pH7.4。

1.2 仪器设备

1200 Infinity Series紫外高效液相色谱分析仪，美国安捷伦科技有限公司（上海）；Agilent 7890A气相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司（上海）。

1.3 试验方法

1.3.1 人源性丁酸梭菌TK520的筛选方法

粪便样品来源为天津健康人群，共5份（女性3份男性2份），年龄10～27岁，每份约10 g（采样前2周内未服用过任何抗菌类药物）。分别用90 mL无菌生理盐水溶解，梯度稀释，用RCM固体培养基倾注平板厌氧培养，反复2次挑取单菌落，接种于BHI液体培养基试管中厌氧培养，筛选出纯化菌种，并对其基因组测序进行菌种鉴定。

1.3.2 丁酸梭菌TK520与标准菌株ATCC19398耐氧性的对比

取丁酸梭菌TK520和丁酸梭菌标准菌株ATCC19398甘油管，在BHI培养基上接种相同菌量，厌氧培养获得一级种子液。试验组：取2种丁酸菌一级种子液，相同接种量分别接入二级BHI培养基中，培养基装液量依次为80%、70%、60%、50%，封盖，限氧条件培养24 h，获得试验组二级发酵液。对照组：取2种丁酸菌一级种子液，相同接种量分别接入二级BHI培养基中，装液量80%，37℃厌氧培养获得对照组二级发酵液。利用紫外分光光度计对获得的二级发酵液进行菌体浓度（OD600nm） 测定。

1.3.3 α-酮异己酸的分析方法

取菌种甘油管，接种于10 mL BHI液体培养中厌氧培养，后转接于低聚葡萄糖发酵培养基，厌氧培养，加入不同浓度的前体物L-亮氨酸母液（25 mmol/L、50 mmol/L、75 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L） 孵化 10 h、12 h、14 h、16 h、18 h后，离心取上清，过膜处理后，按紫外高效液相色谱条件进行发酵产物α-酮异乙酸（KIC） 分析测定。

1.3.4 丁酸梭菌TK520发酵产水解酶特性研究

取菌种甘油管，接种于10 mL BHI液体培养中厌氧培养，振荡混匀，取2 mL菌液于40 mLFOS液体培养基，厌氧培养后离心，取上清液即为待测发酵样品。按照GB/T 23527—2009中Folin试剂显色法制备样品，用分光光度计测定OD680nm，测定丁酸梭菌TK520发酵生产蛋白酶特性。按照GB/T 23874—2009木聚糖酶测定法制备样品，用分光光度计测定OD540nm，测定丁酸梭菌TK520发酵生产木聚糖酶特性。

2 结果与讨论

2.1 菌种筛选测序结果

试验共得到11个分离菌株，将菌株聚合酶链式反应（PCR） 后进行16S rDNA测序，筛选得到一株丁酸梭菌，命名为丁酸梭菌TK520。在GenBank数据库中，可以找到丁酸梭菌TK520的基因组信息，其编号为 CP016332、CP016333和CP016334。

2.2 丁酸梭菌TK520与标准菌株ATCC19398耐氧性的对比

丁酸梭菌TK520与标准菌株ATCC19398在不同氧气条件下所得菌液的菌体浓度见表1。

表1 两种丁酸梭菌不同氧气条件下所得菌液的菌体浓度

由表1可知，对照组中，2种丁酸梭菌的菌浓均在1.8以上，丁酸梭菌TK520略高于标准菌株。试验组中，装液量为80%时，2种丁酸菌菌浓仍保持在1.8以上，随着装液量的减少，限制氧的增加，标准菌株发酵液的菌浓出现大幅度下降，而丁酸梭菌TK520发酵液的菌浓减少幅度小；当装液量下降至50%时，丁酸梭菌ATCC19398发酵液的菌浓仅有0.3左右。所以，丁酸梭菌TK520耐受存在限制氧的繁殖环境，较标准菌株ATCC19398有显著的耐氧性。

2.3 丁酸梭菌TK520产α-酮异己酸特性分析

丁酸梭菌TK520产α-酮异己酸（KIC） 的情况如图1所示。由图1可知，当孵化时间相同时，KIC的产量随着底物浓度的增加而逐渐增加；当底物浓度相同时，KIC的产量先增加后降低。当添加150 mmol/L的L-亮氨酸37℃孵化16 h时，丁酸梭菌TK520产KIC最高，为（6.23±0.75） mg/L。

图1 丁酸梭菌TK520产KIC（±SD，n=3）

2.4 丁酸梭菌TK520发酵液酶活分析

2.4.1 丁酸梭菌TK520产蛋白酶特性分析

丁酸梭菌TK520发酵时产生的蛋白酶酶活力测定结果见图2。

图2 利用7种低聚糖测定蛋白酶酶活力（±SD，n=3）

由图2可知，丁酸梭菌TK520利用低聚果糖（FOS） 发酵时，发酵液中蛋白酶酶活力最高，为（50.74±1.82） U/mL，说明丁酸梭菌TK520作为动物饲用添加剂可以在动物肠道内协助分解蛋白类成分，促进动物消化。

2.4.2 丁酸梭菌TK520产木聚糖酶特性分析

图3 利用7种低聚糖测定木聚糖酶活力（±SD，n=3）

由图3可知，丁酸梭菌TK520利用低聚木糖（XOS）发酵产木聚糖酶的酶活力最高，为（2.5±0.04） U/mL。

3 结论

本试验筛选出的丁酸梭菌TK520包含耐氧编码基因，与标准菌株相比耐氧性显著。当添加150 mmol/LL-亮氨酸37℃孵化16 h时，其KIC产量最高，为（6.23±0.75） mg/L；利用FOS发酵时，丁酸梭菌TK520发酵液中蛋白酶酶活力最高，为（50.74±1.82） U/mL；利用XOS发酵产木聚糖酶的酶活力最高，为（2.5±0.04） U/mL。