不同消毒剂对果汁管道中耐酸耐热菌杀灭效果的研究

邵 娟王晓东 马 欣 成少宁 许先猛

（运城职业技术学院健康学院，山西运城 044000）

耐酸耐热菌是一类耐酸、耐热、严格需氧、无致病性的杆状细菌，生长pH范围为2.0～6.0，生长温度范围为20℃～70℃，因其细胞模中含有特殊的W-环状脂肪酸，常规巴氏杀菌不能将其杀灭，反而起一个热冲击的作用，刺激耐酸耐热菌芽孢的形成和生长。耐酸耐热菌中的酸土脂环芽孢杆菌和酸热脂环芽孢杆菌等可以代谢产生不良风味物质——愈创木酚和卤酚，进而导致产品腐败，给企业造成重大经济损失。

目前国内外的研究主要集中在对耐酸耐热菌的检验、鉴定、水果表面清洗及果汁中该菌的控制方面，其中大多处于实验室阶段，而在果汁实际生产中管道会被耐酸耐热菌污染，由于设备中管道复杂，死角较多，若消毒不彻底，会引起交叉污染。PODOLAK等将接种有耐酸耐热菌芽孢的苹果汁涂抹在不锈钢表面上，晾干并用无菌水处理后用不同消毒剂进行消毒，虽然该试验接近于实际生产，但由于不锈钢表面比较粗糙，不能准确反映消毒的效果。余清等用消毒剂对设备中的管路进行消毒，取得了良好的效果，但并没有对不同的消毒剂杀菌效果进行比较。ORR等研究了5种消毒剂对浓度为107CFU/mL的耐酸耐热菌芽孢的消毒效果，由于管道设备经过冲洗后，残留的耐酸耐热菌数量较少，该试验中消毒剂使用浓度并不适用于管道消毒。本文通过对3种不同品牌消毒剂对耐酸耐热菌的杀灭效果进行初步评价，以找出杀灭耐酸耐热菌的较好的消毒剂，旨在为生产车间中的设备消毒、耐酸耐热菌的防治提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

YSG培养基：酵母粉（MERCK）；葡萄糖，天津市天力化学试剂有限公司；可溶性淀粉（MERCK）；琼脂 （MERCK）。

消毒剂：消毒剂A（过氧乙酸15%,过氧化氢＜23%）；消毒剂B（过氧乙酸16.3%，过氧化氢22.6%）；季铵盐类消毒剂C（六亚甲基四胺27%～33%+季铵盐 10%～12%)。

中和剂：胰蛋白胨，北京路桥技术股份有限公司；硫代硫酸钠，广东汕头市西陇化工厂；吐温，成都科龙化工试剂厂；卵磷脂，天津市博迪化工有限公司；氯化钠，天津市大茂化学试剂厂；氯化钙，广东汕头市西陇化工厂；氯化镁，广东汕头市西陇化工厂。

中和剂：0.5%硫代硫酸钠+0.5%吐温+0.3%卵磷脂的TPS为季铵盐类消毒剂的中和剂；1%硫代硫酸钠为过氧乙酸和过氧乙酸与过氧化氢复合消毒剂的中和剂。

菌种：耐酸耐热菌阳性菌种，陕西海升发展股份有限公司运城分公司。

1.2 仪器与设备

LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SW-CJ-16无菌操作台，苏州净化设备有限公司；PYX-DHS-40X50-BS隔水式电热恒温培养箱，上跃进医疗器械厂；HH-8数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；HPD-25真空泵；PHS-3C精密酸度计，上海虹益仪器仪表有限公司；CP224S分析天平，北京赛多利斯仪器公司；HY-4多功能震荡器，金坛富华；0.45 μm微孔滤膜。

1.3 试验方法

1.3.1 增菌及菌液浓度的确定

将斜面培养的纯耐酸耐热菌接种至灭菌的浓缩果汁中，45℃下培养5 d，吸取1 mL菌液稀释至不同浓度，每一稀释度接种3个平皿进行培养，选取菌落数在15 CFU～300 CFU的平板进行计数，3个平板的菌落平均值乘以稀释倍数，即得每毫升原样液中的菌量。

1.3.2 中和剂鉴定试验

依据卫生部颁布的《消毒技术规范》2002版，首先需要评价中和剂、消毒剂及中和产物对耐酸耐热菌生长状况的影响，试验共分为6组，第1组：消毒剂+菌悬液→培养；第2组：（消毒剂+菌悬液）+中和剂→培养；第3组：中和剂+菌悬液→培养；第4组：（消毒剂+中和剂） +菌液→培养；第5组：稀释液+菌悬液→培养；第6组：稀释液+中和剂+培养基→培养；然后按照中和剂悬液定量鉴定试验操作程序进行操作。

1.3.3 悬液定量杀菌试验

果汁厂管道经过清洗后，消毒前的漂洗水中耐酸耐热菌的浓度较小，并根据消毒剂说明书上推荐的稀释浓度和消毒时间，用无菌硬水将不同消毒剂稀释至质量浓度为0.1%、0.2%、0.25%，消毒时间定为10 min，在20℃条件下进行试验。先加入1 mL试验用菌悬液，混匀，置20℃±1℃水浴中5 min后，用无菌吸管吸取上述质量浓度消毒液9 mL注入其中，迅速混匀并立即记时10 min。各管试验菌与消毒剂混合液经加90 mL中和剂作用10 min后，测定存活菌数。每管样液接种2个平皿，同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。所有试验样本均通过抽滤后，按照耐酸耐热菌的检测方法，在45℃恒温箱中培养5 d，观察最终结果，试验重复3次求平均值，并计算杀灭率。

2 结果与分析

2.1 菌液浓度的确定

由于漂洗水中耐酸耐热菌浓度较小，为了与生产实际相符，并节约成本，消毒试验的耐酸耐热菌通过稀释后的菌液浓度为1.0×103CFU/mL。

2.2 中和剂试验结果

过氧乙酸和过氧乙酸与过氧化氢复合消毒剂的中和剂试验中所加菌液的浓度为1.0×103CFU/mL，通过预试验可知当所加菌液的浓度为1.0×103CFU/mL时，季铵盐类消毒剂第一组还有大量菌生长。章迎春等通过降低消毒剂浓度解决了因消毒剂指示浓度过高而造成的中和剂判定困难的问题，本文因消毒剂浓度较低而使消毒剂的中和剂判定困难，因此调整季铵盐类消毒剂的中和剂试验中所加菌液的浓度为1.0×102CFU/mL，结果见表1，以下数据为3次试验结果的平均值。根据中和剂判定标准，选定0.25%作为中和剂试验的消毒剂浓度。

表1 消毒剂A、B、C的中和剂选择试验结果

由表1可知，消毒剂的中和剂试验中，第3、4、5组菌数相近，其误差率≤10%；第6组无菌生长；第2组菌明显少于3、4、5组；第1组不长菌或明显少于第2组，结果表明中和剂及中和产物对耐热耐酸菌的生长均无显著影响，因此判定1%的硫代硫酸钠为过氧乙酸和过氧乙酸与过氧化氢复合消毒剂的中和剂；0.5%硫代硫酸钠+0.5%吐温+0.3%卵磷脂的TPS为季铵盐类消毒剂的中和剂，这些成分可以很好的中和残留的消毒剂，保证消毒时间的准确性。

2.3 不同浓度消毒剂杀菌情况

不同浓度消毒剂杀菌情况分别见表2、表3。

由表3可知，当消毒剂质量浓度分别为0.1%、0.2%、0.25%时，同一种消毒剂随着消毒剂浓度的增加，消毒效果明显增强，杀灭率呈上升趋势。当质量浓度为0.1%、0.2%时，消毒剂A的消毒效果要好于消毒剂B，当质量浓度为0.25%时，消毒剂A和消毒剂B对耐酸耐热菌都达到完全杀灭，但季铵盐的杀灭率较小，仅为82.9%。

表2 不同浓度消毒剂杀菌试验结果报告

表3 不同浓度消毒剂杀灭率结果报告

3 讨论

3.1 中和剂试验

消毒剂与微生物作用到达规定时间的终点时，分别加入适宜种类和浓度的中和剂，将残留消毒剂迅速中和，使其不再持续抑制或杀灭微生物，过氧乙酸与过氧化氢复合消毒剂的主要成分具有氧化作用，因此选用具有还原作用的硫代硫酸钠作为这些消毒剂的中和剂。季铵盐类消毒剂主要成分为醛类衍伸物和季铵盐，其中和剂的主要成分为硫代硫酸钠，由于市售季铵盐消毒剂多为复合型，即含相关活性物质和表面活性剂以提高杀菌效果和保持稳定性，在对其残余杀菌力进行清除时应同时中和其活性物质，这样才能避免错误的判断，因此季铵盐类消毒剂的中和剂中加入了卵磷脂、吐温-80以保证检测结果的准确性。

3.2 消毒试验

由试验结果可知，消毒剂在稀释浓度分别为0.1%、0.2%、0.25%，消毒时间为10 min时，过氧化物类消毒剂消毒效果要好于季铵盐类。季铵盐消毒剂消毒机理为破坏细胞壁和细胞膜，菌体物质外渗，使蛋白质和酶变性，抑制酶系统，影响细胞代谢，对部分微生物杀灭效果不好，如分枝杆菌、肠道病毒等。过氧化物类消毒剂具有强氧化性，不仅能破坏微生物的通透性屏障，使内容物流出，与酶、氨基酸等发生反应，而且能进入菌体后作用于DNA的磷酸二酯键使DNA断裂，并分解组成DNA的4种碱基，阻碍DNA的合成，可以快速杀灭细菌繁殖体、真菌、病毒、分枝杆菌、细菌芽孢等。与季铵盐类消毒剂相比，过氧化物类消毒剂更多的从基因层面对菌体进行破坏，这与郑吟秋、洪令瑶等的研究相符。在试验中当质量浓度为0.1%和0.2%时，消毒剂A的消毒效果要好于消毒剂B，但两者所含有效成分及含量相似，这可能与消毒剂A中含有的其他附加物有关，在此浓度下，消毒剂A和消毒剂B对耐酸耐热菌都没有达到完全杀灭，因此在果汁管道中的耐酸耐热菌的消毒方面建议使用质量浓度为0.25%的消毒剂A或消毒剂B，此试验还停留在实验室阶段，在榨季对管道中耐酸耐热菌的线上消毒将是下一步研究的重点。