酶法辅助提取柳叶蒿挥发油的研究*

周金沙朱 良徐睿鑫

1（湖南省食品安全生产工程技术研究中心，湖南长沙410016）

2（华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州510641）

3（长沙市食品药品检验所，湖南长沙410016）

我国约有180余种和44个变种的蒿属植物（Artemisia L.），其中许多种是中国传统药用植物，如青蒿、黄花蒿、茵陈、艾蒿等，这些被用来治疗疟疾、肝炎、高血压、青紫、过敏、黄疸、癌症、炎症等各种疾病，以及由微生物引起的感染等。

柳叶蒿（Artemisia integrifolia L.）主要分布在我国大陆北方以及蒙古、俄罗斯等地，是菊科蒿属的多年生草本植物。柳蒿芽是柳蒿植株地上部分幼嫩的茎叶，其营养丰富、质嫩味香，风味独特。民间流传柳蒿芽，具有清热解毒、去火、消炎、利尿等功效，对于肝硬化及肝炎具有一定的疗效和防治作用。通过前期研究发现，柳叶蒿精油具有广谱的抗菌活性，主要成分为氧化单萜，如莰酮（12.65%）、艾蒿酮（11.78%）、桉油精（6.28%）、茴蒿醇（6.56%）等。本试验采用纤维素酶法辅助提取柳叶蒿挥发油，并利用单因素试验和正交试验优化了酶法辅助提取工艺,为柳叶蒿挥发油的酶法辅助提取提供数据参考和工艺示范，并为柳叶蒿的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

柳叶蒿的地上部分，于2017年10月在中国山西省五台山采集。

恒温数显水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；分析天平，德国赛多利斯公司；pH计，梅特勒托利多上海有限公司；数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；玻璃反应釜，巩义予华仪器有限公司。

1.1.3 主要试剂

纤维素酶，10 000 U/g，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余试剂均为分析纯，试验用水为蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 精油提取

柳叶蒿晒干后粉碎，过10目筛。称取200 g干粉，装入5 L烧瓶中，加入蒸馏水，加纤维素酶，调节pH值，在一定温度下酶解一定时间后，按2010年版《中华人民共和国药典》中方法，水蒸气蒸馏提取6 h，得到的挥发油用无水硫酸钠干燥24 h，过滤，然后密封于棕色玻璃瓶中，在4℃下保存。

1.2.2 单因素试验

美可以粗略地分为两个层次，一种是事物以其外在的感性形式所呈现的感性美；另一种是以其内在结构的和谐、秩序而具有的理性美，尤其数学之美。

选定好合适的酶后，分别考察加酶量（40 U/g原料 ～160 U/g原料）、pH（4.2～5.6）、酶解温度（35℃～60℃）、处理时间（1h～7h）、液料比（5∶1～30∶1）对柳叶蒿挥发油得率的影响。

1.2.3 正交试验

根据上述单因素试验结果，采用正交设计，选取加酶量、酶解时间、酶解pH值、酶解温度为影响因素，采用L9（34）正交表进行四因素三水平正交试验。通过测定各组样品挥发油得率，选出最佳工艺条件。

1.2.4 验证试验

精密称取同一批柳叶蒿粉末3份，按优选的工艺进行酶解后，加水蒸馏提取，另取同一批的柳叶蒿粉末3份，不酶解直接加水蒸馏提取，分别测定挥发油提取率。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 加酶量对挥发油提取率的影响

称取7份200.0 g柳叶蒿粉末，分别加入5 L烧瓶中，每份加入2.0 L蒸馏水摇匀、浸泡，纤维素酶加入量分别为40 U/g原料、60 U/g原料、80 U/g原料、100 U/g原料、120 U/g原料、140 U/g原料、160 U/g原料，控制酶解温度50℃，溶液pH值为5.0，酶解时间为4.0 h，考察不同加酶量对柳叶蒿挥发油提取率的影响，结果可见图1。

图1 加酶量对柳叶蒿挥发油提取率的影响

从图1可看出，加酶量低于100 U/g原料时，柳叶蒿挥发油提取率随着纤维素酶加入量的增加而增加；但加酶量超过100 U/g原料时，酶解作用的效果不明显，挥发油提取率有降低趋势。

2.1.2 溶液pH 值对挥发油提取率的影响

称取8份200.0 g柳叶蒿粉末，分别加入5 L烧瓶中，每份加入2.0 L蒸馏水摇匀、浸泡，纤维素酶加入量为100 U/g原料，控制酶解温度50℃，酶解溶液pH值分别为4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6，酶解时间为4.0 h，考察酶解溶液pH值对柳叶蒿挥发油提取率的影响，结果见下页图2。

从图2可看出，溶液pH值小于4.8时，柳叶蒿挥发油提取率随着pH值的升高而增加；当pH值超过4.8时，挥发油提取率有所降低。

2.1.3 酶解温度对挥发油提取率的影响

图2 酶解溶液pH值对柳叶蒿挥发油提取率的影响

称取6份200.0 g柳叶蒿粉末，分别加入5 L烧瓶中，每份加入2.0 L蒸馏水摇匀、浸泡，纤维素酶加入量为100 U/g原料，酶解温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃，酶解时间为4.0 h，考察酶解温度对挥发油提取率的影响，结果可见图3。

图3 酶解温度对柳叶蒿挥发油提取率的影响

从图3可看出，酶解温度低于50℃时，柳叶蒿挥发油提取率随着酶解温度的升高而增加；当酶解温度高于50℃时，挥发油提取率随温度上升而下降。

2.1.4 酶解时间对挥发油提取率的影响

称取7份200.0 g柳叶蒿粉末，分别加入5 L烧瓶中，每份加入2.0 L蒸馏水摇匀、浸泡，纤维素酶加入量为100 U/g原料，酶解温度为50℃，溶液pH值为4.8，酶解时间分别为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h，考察酶解时间对挥发油提取率的影响，结果见图4。

从图4可看出，当酶解时间少于3.0 h时，柳叶蒿挥发油提取率随酶解时间的增加而增加；在酶解3.0 h时后，挥发油提取率趋于稳定。

2.1.5 液料比对挥发油提取率的影响

图4 酶解时间对柳叶蒿挥发油提取率的影响

称取6份200.0 g柳叶蒿粉末，分别加入烧瓶中，每份加入不同体积蒸馏水摇匀、浸泡（蒸馏水与柳叶蒿粉末比例为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1），纤维素酶加入量为100 U/g原料，酶解温度为50℃，溶液pH值为4.8，酶解时间为3 h，分别考察酶解液料比对挥发油提取率的影响，结果见图5。

图5 酶解液料比对柳叶蒿挥发油提取率的影响

从图5可看出，液料比少于15∶1时，柳叶蒿挥发油提取率随液料比的增加而增加；当液料比超过15∶1时，挥发油提取率趋于稳定。

2.2 正交试验结果

根据单因素试验的结果，选出对柳叶蒿挥发油提取率有较大影响的4个主要影响因素，分别为纤维素酶加酶量、酶解pH值、酶解温度、酶解时间，采用正交试验对酶解条件进行优化，因素水平设计见表1，正交试验结果见下页表2，方差分析见下页表3。

表1 正交试验因素水平

从表2可看出，各因素对柳叶蒿挥发油提取率影响的大小次序为C>B>A>D，即酶解温度对柳叶蒿挥发油提取率的影响最大，其次为酶解pH值、加酶量，酶解时间的影响最小。在选定的水平中，各因素最优水平为A2B2C2D3，即加酶量为100 U/g原料，酶解溶液pH为4.8，酶解温度为50℃，酶解时间为4 h。

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

验证试验结果显示，在最优提取条件下，柳叶蒿挥发油的提取率可达1.17%，高于正交试验的所有结果；而未经酶解处理的柳叶蒿挥发油提取率仅为0.69%，酶解法辅助提取与未经酶解法提取相比，其提取率提高了0.48%。

3 结论

通过前期相关研究可知，柳叶蒿挥发油有显著的抑菌功能，而且可以与缓释剂复合作为食品用缓释抑菌剂。本试验采用纤维素酶酶解辅助水蒸馏提取柳叶蒿挥发油，较同等条件下不加酶处理的提取率提高了0.48%，说明该方法具有一定的优势，为进一步开展柳叶蒿保健及药用方面的研究奠定了基础，同时为其挥发油的规模化生产提供新工艺。