HR-HPV检测与p16和ki67在宫颈腺上皮病变中的诊断价值

戈文舜，包 磊，鲁 波，任丽芳，李美平，杨惠英，蔡红光

(绍兴市妇幼保健院病理科，浙江绍兴312000)

近年来，宫颈癌筛查工作的广泛开展及癌前病变的早发现、早治疗，使宫颈鳞癌发病率有所下降，但是宫颈腺癌却逐年上升。由于宫颈浸润性腺癌(invasive cervical adenocarcinoma，ICA)及前驱病变发病隐匿、筛查方法局限(液基细胞学不敏感、组织学镜下形态多变，个别类型异型性小)以及诊断标准不一等情况，容易造成病变漏、误诊。2014版世界卫生组织女性生殖器官肿瘤分类中对宫颈腺癌前驱病变仅保留了原位腺癌(adenocarcinoma in situ，AIS)[1]的概念，即宫颈腺性上皮内病变，含有恶性形态，若不治疗，则有显著进展为浸润性腺癌的风险。镜下往往有重度细胞异型及明显的核分裂、凋亡。形态有争议者，建议行免疫组化p16、ki67检测，若p16强阳性表达，ki67高增殖指数，则定义为具有免疫组化特征、形态学不完整的原位腺癌。同时提出除宫颈胃型黏液性癌及中肾管型腺癌外，其余类型绝大部分与HPV感染密切相关。本研究的目的就是观察宫颈腺癌及原位腺癌和良性腺上皮病变(benign endocervical glands，BEG)中高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染状态和p16、ki67表达情况,探讨三项指标与宫颈腺癌及原位腺癌的关系，以提高其诊断检出率。

1研究对象与方法

1.1研究对象

选取2016年1月至2017年12月在绍兴市妇幼保健院诊断的宫颈腺上皮病变患者82例，其中原位腺癌18例，浸润性腺癌23例(普通型腺癌10例，黏液性癌7例，其他类型腺癌6例：绒毛状腺癌2例、子宫内膜样腺癌1例、透明细胞癌1例、腺鳞癌1例、低分化腺癌1例)，良性腺上皮病变(宫颈息肉19例、纳氏囊肿8例、隧道样腺丛1例、微腺体增生13例)41例。患者年龄26～81岁，平均年龄45.88岁。同时行HR-HPV分型和免疫组化p16、ki67的检测。组织学切片由三位高年资病理医生复阅全部病理切片，至少两位医师意见一致则确定为最后诊断。诊断标准参照2014年世界卫生组织女性生殖系统肿瘤病理学和遗传学分类标准。

1.2方法

1.2.1 HPV分型检测

采用罗氏公司生产的cobas 4800 HPV检测系统，检测原理是基于PCR反应结合不同荧光染料的探针检测高危型，可检出HPV16型、18型及其他12种高危型HPV(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)。试剂全部来自罗氏公司生产的配套试剂盒，操作方法按照试剂盒说明书进行。

1.2.2免疫组织化学染色

标本经10%中性福尔马林固定，2～3μm厚石蜡切片，常规脱水、石蜡包埋切片。一抗p16(6H12)试剂、ki67(MIB-1)试剂、Envision试剂盒均购自Dako。免疫组化操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.2.3免疫组织化学阳性标准

p16：病变细胞核与/或胞浆连续强阳性表达标记为(+)；细胞核与/或胞浆灶性、斑片状强弱不等的表达或完全不表达标记为(-)。ki67：阳性信号位于胞核，以阳性细胞百分比数来体现细胞增殖指数。以30%为界限区分良性病变与肿瘤性病变(≤30%；>30%)。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0软件对数据进行分析，计数资料进行χ2检验和χ2分割法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 HR-HPV(16/18)的检出率

41例ICA及AIS中HR-HPV阳性35例(85.37%)，其中HPV16/18型33例(94.28%)；41例BEG中HR-HPV阳性15例(36.59%)，其中HPV16/18型10例(66.67%)。二者相比，ICA及AIS的HR-HPV，特别是HPV16/18检出率，显著高于BEG(χ2值分别为20.50、6.65，均P<0.05)。在ICA与AIS的比较中，单一感染HPV16型为27.27%(3/11)和72.73%(8/11)，与单一感染HPV18型66.67%(10/15)和33.33%(5/15)比较，差异有统计学意义(χ2=3.94，P<0.05)，ICA与AIS中HPV16/18混合感染检出率(23.53%vs.16.67%)比较差异无统计学意义(χ2=0.26，P>0.05)，见表1。不同亚型(普通型腺癌、黏液性癌、其他类型腺癌)ICA中HR-HPV检出率比较差异无统计学意义(χ2=2.53，P>0.05)，见表2。

表1 宫颈腺上皮病变中HPV(16/18)、p16和ki67的表达对比[n(%)]

表2 不同组织学类型的宫颈腺癌中HR-HPV、p16和ki67的表达对比[n(%)]

2.2 p16、ki67的表达及价值

41例ICA及AIS中35例p16阳性表达(85.37%)，36例ki67(+，>30%)(87.80%)；41例BEG中3例p16阳性表达(7.32%)，2例ki67(+，>30%)(4.88%)，ICA及AIS的p16、ki67高表达明显高于BEG(χ2值分别为50.22、56.69，均P<0.05)，见表1、图1；但不同亚型ICA中p16、ki6表达比较无明显差异(χ2值分别为2.53、0.16，均P>0.05)，见表2、图1、图2、图3。单纯行p16与联合ki67在ICA及AIS中诊断敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为85.37%和94.12%、92.68%和97.37%、92.11%和96.97%、86.36%和94.87%，见表3。

表 3 单独p16及联合ki67检测在宫颈腺上皮病变中的分布对比[n(%)]

图1 AIS镜下示细胞重度异型、基底部凋亡小体及“腔缘”核分裂(HE染色，×100)

Fig.1 Severe cellular atypia, apoptotic bodies in basal surface and mitotic figures in lumenal surface in AIS under microscope (HE staining, x100)

图2 AIS免疫组化ki67增殖指数(+，50%)(Envision，×100)

Fig.2 Immunohistochemical ki67 proliferation index in AIS (+，50%) (Envision, x100)

图3 AIS免疫组化p16呈现细胞核/或浆弥漫强阳性表达(Envision，×100)

Fig.3 AIS showed continuous strong positive expression of p16 in lesion nucleus or cytoplasm (Envision, x100)

2.3宫颈腺上皮病变中HR-HPV(16/18)检出率与p16的关系

35例呈HR-HPV阳性的ICA及AIS中均显示p16阳性，6例HR-HPV阴性的ICA病例p16均阴性。35例HR-HPV阳性ICA及AIS中33例HPV16/18及p16阳性(94.29%)，15例HR-HPV阳性BEG中2例HPV16/18及p16阳性(13.33%)，两者比较有统计学意义(χ2=7.59，P<0.05)。15例HR-HPV阳性的BEG中2例p16阳性(13.33%)，26例HR-HPV阴性的BEG中1例p16阳性(3.85%)，两者比较差异无统计学意义(χ2=1.26，P>0.05)，见表4。

表4宫颈腺上皮病变中HR-HPV与p16的相关性[n(%)]

Table 4 Correlation between HR-HPV and p16 detection in cervical glandular epithelial lesions[n(%)]

3讨论

3.1 HPV(16/18)感染在宫颈腺上皮病变中的分布特点

HR-HPV持续感染，特别是HPV16/18型，在宫颈腺癌的病因学作用已经被证实[2]。它可将自身DNA整合到宿主细胞基因组中，其基因产物E6、E7原癌蛋白能引起宿主调节基因表达失调，从而使细胞不断增殖，病变程度随着HR-HPV与宿主染色体整合率的提高而升高。本研究数据可以看出ICA及AIS的HR-HPV(特别是HPV16/18)检出率显著高于BEG，故其发生发展与HPV(16/18型)感染密切相关。同时，提示单一HPV18型感染较HPV16型更多见于ICA，单一HPV16型感染较HPV18型更多见于AIS，而HPV16/18混合感染检出率两者比较差异无统计学意义。这与文献报道[3-5]相似，HPV18型较HPV16型更多见于宫颈腺癌及原位腺癌，而HPV16型与宫颈鳞癌关系最为密切。在HPV16和HPV18双重感染中，比起任一型别单一感染，并不增加宫颈癌发生的风险。在活检或锥切标本中诊断AIS或ICA时，若单一HPV18感染，则需要警惕ICA的可能；而单一HPV16感染的AIS，后续病变是否仍为AIS或切缘阴性者后续无残留病变，还需要进一步加大样本量深入研究。

3.2 p16与ki67在宫颈浸润性腺癌及原位腺癌中的诊断价值及与HPV的相关性

p16是一种细胞周期素依赖性激酶抑制物，可通过抑制CDK4/CDK6的活性从而抑制Rb蛋白的磷酸化，进而抑制转录因子E2F活性，使细胞分裂停滞于G1期。HR-HPV产生的E7蛋白可与pRb结合，使其失活，释放E2F，使p16反馈性升高[6-7]。ki67是一种反映细胞增殖活性的免疫标志物。当ki67高表达时提示细胞生长活跃，>30%时往往提示了肿瘤性病变的存在[8-9]。本实验在ICA及AIS中我们发现p16呈现细胞核、细胞浆连续一致的强阳性表达，ki67增殖指数在30%～90%之间，而在BEG中p16则为灶性斑片状强弱不等或者完全不表达，ki67一般在5%～30%，且两者表达具有显著差异(P<0.05)。p16联合ki67在ICA及AIS中诊断敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值均高于单纯行p16，同时数据提示HR-HPV(16/18)检出率与p16阳性存在高度一致性，这表明p16、ki67的强阳性高表达不仅在低级别和高级别鳞状上皮内病变[9-10]中，而且在HPV感染导致的腺上皮良恶性病变鉴别上起着重要的辅助诊断作用。

尽管绝大部分ICA及AIS可以发现HR-HPV感染及p16、ki67强阳性高表达，但还是存在极少数与HPV感染不相关且p16阴性的宫颈腺癌[11]，譬如胃型黏液性癌[12-13]、中肾管型腺癌[12,14]、透明细胞癌[12,15]和浆液性癌[12,16]，甚至存在非HPV依赖机制的p16阳性表达。本研究由于病变基数及特殊类型病例数较少，导致研究结论有所偏倚。但无论是否HPV感染导致的宫颈腺癌，都需要医疗机构加强妇科首诊医师、阴道镜检查医师和病理诊断医师之间的联系，定期回顾和总结。对于无症状者做好随访工作；有异常临床症状(如性交后出血、异常阴道流血或排液、子宫颈表面柱状上皮外移等)者，必要时可行阴道镜及宫颈管内膜搔刮术；对于活检有疑问者，建议借鉴HPV感染型别及行免疫组化p16、ki67辅助诊断。

ICA及AIS的发生发展与HR-HPV(16/18)感染密切相关，呈现p16、ki67的强阳性、高表达。HR-HPV(16/18)感染与p16阳性存在高度一致性。单一HPV18型感染多见于ICA，单一HPV16型感染多见于AIS。宫颈活检或锥切标本为AIS伴单一HPV18感染时，需要警惕ICA的可能。总之，宫颈腺上皮病变的诊断不仅需要掌握组织学镜下形态、免疫组化p16和ki67的表达，还需要了解患者HPV感染情况、临床病史及体征，做到早发现、早治疗，以降低宫颈腺癌的发病率和死亡率。