低场核磁结合电子鼻判定复合保鲜剂对冷藏虹鳟鱼片品质变化的影响

沈秋霞 朱克永 李明元 钱 杨 许童桐 吴李川 袁 洋

(1.四川工商职业技术学院，四川 都江堰 611830；2.西华大学，四川 成都 610039)

虹鳟为一种冷水鱼类，其生长的水域温度为16～18 ℃[1]。虹鳟肉质鲜美，含有丰富的蛋白质、多不饱和脂肪酸、矿物质及维生素等营养物质，是国际公认的优质食用鱼[2-4]。由于虹鳟鱼肉水分含量高，同时含有丰富的营养物质，在贮藏及销售过程中极易发生腐败变质。

目前，水产品防腐保鲜已成为近年来广大消费者十分关注的问题，而生物保鲜剂因其无毒无害的特点，是目前水产品防腐保鲜最主要的研究热点之一。于林等[5]研究发现茶多酚改性后的胶原蛋白—壳聚糖复合膜可抑制冷藏斜带石斑鱼的理化指标及细菌总数。Qiu等[6]利用壳聚糖结合甘油提取物对鲳鱼进行涂膜保鲜，发现处理组鱼片的TBA值更低，同时鱼片失水率也降低。Li等[7]采用1.5%壳聚糖与0.2%茶多酚对大黄鱼进行保鲜研究，发现两种保鲜剂复合能有效抑制微生物生长，将货架期延长8～10 d。Serap等[8]研究发现，经柠檬汁处理后的鳕鱼感官得分优于对照组，同时能够抑制细菌的生长延长鳕鱼货架期。而近年来关于壳聚糖、茶多酚结合柠檬汁应用于虹鳟鱼片的保鲜研究鲜有报道。

水产品常见的新鲜度评价方法主要有感官、微生物检测及理化指标检测等，而这些方法存在耗时长且对样品具有破坏性等缺点。近年来在食品检测领域逐渐出现了一些快速检测技术，如电子鼻、电子舌、低场核磁共振技术等。杨震等[9]采用电子鼻技术结合感官及理化指标分析了冷藏秋刀鱼片的新鲜度变化，发现电子鼻分析结果与感官、理化分析结果显著相关。国内外许多研究学者利用电子舌及核磁共振对羊肉[10]、鳕鱼[11]、鲍鱼[12]等肉类的品质变化进行了相关研究，而目前关于电子鼻结合核磁共振技术快速检测虹鳟鱼片的品质变化研究还未见报道。

试验拟研究4 ℃冷藏条件下，复合保鲜剂(壳聚糖、茶多酚及柠檬汁)处理的真空包装虹鳟鱼片在贮藏期内的质构、理化及微生物指标变化情况，并利用低场核磁共振及电子鼻技术分析鱼片贮藏期间水分含量变化和挥发性成分变化，以此评价复合保鲜剂的保鲜效果，同时为虹鳟鱼片新鲜度快速检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虹鳟：通威(成都)三文鱼有限公司；

柠檬：尤力克，四川安岳产；

平板计数琼脂培养基(PCA)：成都市迪维乐普科技有限公司；

硼酸、盐酸、溴甲酚绿、甲基红、氧化镁、高氯酸、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；

水溶性壳聚糖：食品级，脱乙酰度90%，河南荣申化工有限公司；

茶多酚：食品级，河南千志商贸有限公司。

1.2 仪器与设备

电子分析天平：TB-214型，北京赛多利斯仪器系统有限公司；

全自动定氮仪：K-1100型，山东海能科学仪器有限公司；

紫外—可见分光光度计：UV2800型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

电热恒温培养箱：SGSP-02型，黄石市恒丰医疗器械有限公司；

自动台式灭菌锅：TMQR-3250型，山东新华医疗器械公司；

台式离心机：TD-5M型，四川蜀科仪器有限公司；

便携式电子鼻系统：PEN3型，德国Airsense公司；

低场核磁共振仪：MesoMR23-040V-1型，苏州纽迈分析仪器股份有限公司；

恒温水浴锅：DK-98A型，天津泰斯特有限公司；

真空包装机：TW-BZJ-2-4型，海沃迪智能装备股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 复合保鲜剂浓度的确定 在前期单因素试验的基础上，利用响应面试验对茶多酚、壳聚糖和柠檬汁浓度进行复合配比优化，以硫代巴比妥酸(TBA)值、挥发性盐基氮(TVB-N)值及菌落总数为评价指标，最终确定复合保鲜剂最佳浓度为壳聚糖1.75%，茶多酚0.25%，柠檬汁4.98%。

1.3.2 原料预处理 鲜活虹鳟清洁暂养24 h后，于清洁无菌条件下进行宰杀，经去皮去内脏处理后，采用碎冰包装立即运送至实验室，将鱼肉清洗干净后，取背脊肉并分割成质量相差不大的鱼片，再次用清水清洗干净。将处理好的鱼片分别于蒸馏水(对照组)和复合保鲜剂溶液(1.75% 壳聚糖、0.25%茶多酚、4.98%柠檬汁)中浸泡30 min(鱼片与浸泡溶液体积比1∶4)。取出后自然沥干表面水分，用聚对苯二甲酸二甲酯+聚乙烯(PET/PE)复合包装袋进行真空包装，4 ℃下冷藏，每2 d对鱼片进行微生物、理化指标检测，同时采用低场核磁共振和电子鼻技术对鱼片进行水分含量及挥发性物质的快速检测。

1.4 评价指标测定

1.4.1 质构 参照文献[13]。

1.4.2 pH值 参照文献[14]的方法并略做修改。取10.000 g 绞碎鱼糜于烧杯中，加入蒸馏水100 mL，用玻璃棒搅拌充分后静置30 min，过滤。取滤液50 mL用pH计测其pH值，每组样品做3次平行，取平均值。

1.4.3 TBA、TVB-N值 参照文献[13]。

1.4.4 菌落总数 按GB 4789.2—2010执行。

1.4.5 低场核磁共振 参照文献[11-12]的方法并略做修改。称取2 g样品，用经蒸馏水润湿的滤纸片将鱼肉表面水分拭干，迅速置于玻璃样品管中，将样品管放入磁体腔内进行测试条件探索。利用标准水膜在Q-FID序列下进行仪器校正，依次进行90°，180°脉冲校正，放入样品，探寻最佳采样等待时间和累加次数，在Q-CPMG脉冲序列下进行试验。Q-CPMG序列测定参数为测定温度32 ℃，采样频率100 kHz，主频率20 MHz，90°脉冲脉宽10 μs，180°脉冲脉宽20 μs，采样点数185 672，累加次数4，采样等待时间4 200 ms，回波数3 000，频率漂移937 320.75。使用软件自带的反演软件对试验数据进行反演，得到不同组分水分的弛豫时间(T2)与峰面积图。

1.4.6 电子鼻 参考文献[15-17]的方法。利用电子鼻WinMuster软件对样品进行负荷加载分析、LA分析、PCA分析及雷达图分析，每组样品做6次平行，分析比较去掉异常值。表1为电子鼻各传感器性能。

1.5 数据处理

采用WinMuster、Excel 2006、SPSS 21.0及Oringin 9.0对试验数据进行分析处理。

2 结果与讨论

2.1 复合保鲜剂对冷藏鱼片质构的影响

由图1可知，对照组与保鲜剂组鱼片硬度在贮藏期间先上升后下降，贮藏至第2天时，两组鱼片硬度最大；第6天时，分别下降至754.501，794.396 g；第14天时，分别下降至533.333，556.489 g，与初始值相比分别下降了31.87%，28.91%。随着贮藏时间的延长，对照组与保鲜剂组鱼片弹性均下降，且在贮藏初期(0～2 d)，两组鱼片弹性下降速率缓慢，从第2天开始，对照组的下降速率加快且高于保鲜剂组的；第8天时两组鱼片弹性与初值比较分别下降了12.80%，11.54%，第14天弹性分别下降至0.658，0.678 g。随着贮藏时间的延长，对照组与保鲜剂组鱼片回复性和咀嚼性均逐渐下降，且保鲜剂组的高于对照组；贮藏初期，鱼片回复性为0.177 g，第14天时，对照组鱼片回复性下降至0.121 g，此时保鲜剂组的为0.134 g，说明保鲜剂处理对虹鳟鱼片弹性变化影响不明显(P>0.05)；贮藏结束后，两组鱼片咀嚼性分别为69.322，87.385 g，与初值比较分别下降了47.01%，33.20%，可能是其硬度、弹性及回复性等质构变化导致的。综合表明，使用保鲜剂对虹鳟鱼进行处理可较好地维持其质构特性。

表1 电子鼻传感器性能描述

图1 贮藏期间鱼片的质构

2.2 复合保鲜剂对冷藏鱼片pH值的影响

由图2可知，随着贮藏时间的延长，对照组鱼片pH值呈现波动变化，而保鲜剂组鱼片pH值先下降后上升。贮藏0～6 d，两组鱼片pH值整体呈下降趋势，第6天两组鱼片pH值分别为6.40，6.38；从第6天开始，两组鱼片pH值开始逐渐增加，第10天两组鱼片pH值分别增加至6.54，6.45。这主要是前期细胞进行无氧呼吸产生乳酸，同时糖原发生酵解产生磷酸等物质导致pH值降低，后期蛋白质发生分解作用产生氨及胺类等碱性物质造成pH值上升；在贮藏后期保鲜剂组鱼片pH值低于对照组，可能是保鲜剂的抑菌作用使得鱼肉蛋白质分解缓慢造成的。

图2 贮藏期间鱼片的pH

2.3 复合保鲜剂对冷藏鱼片TBA值的影响

由图3可知，随着贮藏时间的延长，对照组与保鲜剂组鱼片TBA值逐渐增加，且对照组高于保鲜剂组。贮藏0～6 d，两组鱼片TBA值增长趋势平缓，之后对照组TBA值开始急剧增加，第14天两组鱼片TBA值分别增加至0.936，0.725 mg MDA/kg。贮藏期间保鲜剂组鱼片的脂肪氧化速度低于对照组鱼片，可能是由于茶多酚的抗氧化作用减缓了鱼肉的脂肪氧化，同时壳聚糖及柠檬汁的抑菌作用也减缓了微生物对脂肪的分解。

图3 贮藏期间鱼片的TBA值

2.4 复合保鲜剂对冷藏鳟鱼片TVB-N值的影响

由图4可知，随着贮藏时间的延长，鱼片TVB-N值逐渐增加，且对照组高于保鲜剂组。鱼片TVB-N初始值为8.382 mg/100 g，第8天对照组鱼片TVB-N值为22.721 mg/100 g，此时鱼肉新鲜度差，已达到食用临界值[18]；第12天保鲜剂组鱼片TVB-N值为23.854 mg/100 g；贮藏结束时，两组鱼片TVB-N值分别增加至30.684，26.478 mg/100 g，均已腐败。结果表明，经保鲜剂处理鱼片的贮藏期较对照组可延长4 d左右。

图4 贮藏期间冷藏鱼片的TVB-N值

2.5 复合保鲜剂对冷藏鱼片菌落总数的影响

由图5可知，随着贮藏时间的延长，鱼片菌落总数逐渐增加，且对照组高于保鲜剂组。贮藏前期(0～6 d)，保鲜剂组鱼片菌落总数增长缓慢，第6天其增长速度加快；第10天时，对照组鱼片菌落总数为6.25 lg CFU/g，超出可接受水平限量值(5×105CFU/g)[19]；第14天时，保鲜剂组鱼片菌落总数值>5×105CFU/g。保鲜剂组鱼片抑菌效果优于对照组，是由于壳聚糖、茶多酚及柠檬汁均具有抑菌性能，减慢了微生物的生长繁殖。贮藏期间，两组鱼片菌落总数变化趋势与TBA值和TVB-N值变化基本一致。

图5 贮藏期间冷藏鱼片的菌落总数

2.6 复合保鲜剂对冷藏鱼片水分及含量变化的影响

由图6可知，经NMR自身软件反演后的图谱出现3个峰，表明鱼片中存在3种不同状态的水分，其中弛豫时间最短的(T200～10 ms)为结合水，这部分水与细胞内大分子物质结合非常紧密；处于中间的(T2110～100 ms)为不易流动水，这部分水存在肌纤丝、肌纤维及膜之间；弛豫时间最长的(T22100～1 000 ms)为自由水，这部分水存在肌纤维细胞间隙，通过物理作用吸附在鱼肉上，在贮藏过程中特别容易流失[12,20]。随着贮藏时间的延长，两组鱼片T21幅值逐渐降低，峰面积也在不断发生变化；T20幅值变化不明显，T22幅值变化呈波动趋势。

由表2可知，随着贮藏时间的延长，对照组与保鲜剂组鱼片P20先减小后增加，可能是由于肌肉前期无氧呼吸作用产生的乳酸及磷酸等酸性物质致使pH降低，当pH值接近蛋白质等电点时，蛋白质净电荷为0而相互靠近使其水合作用减弱，导致P20减少[21]；两组鱼片在不同贮藏时间的P20差异显著(P<0.05)，贮藏0～4 d，对照组与保鲜剂组鱼片P20差异不显著(P>0.05)。对照组与保鲜剂组鱼片P21先增加后减少，与甄少波等[22]的研究结果一致；两组鱼片在不同贮藏时间的P21差异显著(P<0.05)，第14天时，对照组与保鲜剂组鱼片P21分别为93.83%，94.30%。对照组与保鲜剂组鱼片P22呈现波动变化；贮藏后期(12～14 d)，保鲜剂组自由水比例显著低于对照组(P<0.05)，且两组鱼片自由水比例与初期比较均增加，可能是随着贮藏时间的延长，鱼肉蛋白质结构遭到破坏导致部分不易流动水结合能力减弱流出，存在于肌纤维间隙，不易流动水比例减少而自由水比例增加。

Ai表示对照组，Bi表示保鲜剂处理组，i表示贮藏天数

2.7 复合保鲜剂处理冷藏鳟鱼片的电子鼻分析

2.7.1 LA分析 由图7可知，LA-1、LA-2贡献率分别为65.87%，32.36%，总贡献率达98.23%。对第一主成分贡献率最大的传感器为R2、R7传感器，其分别对氮氧化合物及无机硫化物等挥发性物质灵敏；R1、R8传感器对第二主成分贡献率最大，即对芳香成分物质和乙醇有选择性；R10传感器在坐标轴上接近于零，其响应值可忽略不计，说明对烷烃选择性极小。

2.7.2 PCA分析 通常情况下，第一主成分和第二主成分总贡献率在70%～85%，此分析方法便可使用[23]。由图8可知，PCA-1、PCA-2贡献率分别为65.87%，32.36%，总贡献率为98.23%，说明两种主成分可以反映两种处理方式下的鱼片在不同贮藏时间的整体信息。不同贮藏时间的鱼片与新鲜鱼片均存在一定距离，但对照组在贮藏第2天与第6天响应值存在重叠区域，保鲜剂组在贮藏第2天与第6天响应值情况与对照组相同，说明此阶段鳟鱼片新鲜度差异不大(P>0.05)。贮藏第10天，对照组鱼片挥发性物质响应值区域与初期区域距离明显增大(P<0.05)，表明鱼片在贮藏6 d后开始腐败变质；而保鲜剂组贮藏至第14天时响应值区域与初期区域距离增大，说明鱼片在贮藏10 d后开始腐败。PCA分析结果与TBA值、TVB-N值及菌落总数变化趋势一致。

表2 贮藏期间冷藏鱼片的3种状态水分峰面积†

† P20、P21、P22分别为T20、T21、T22弛豫时间的峰面积；大写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)，小写字母不同表示组内差异显著(P<0.05)。

2.7.3 LDA分析 由图9可知，LD-1、LD-2贡献率分别为70.91%，18.60%，总贡献率为89.51%。随着贮藏时间的延长，对照组鱼片挥发性物质响应值均逐渐增加，保鲜剂组鱼片挥发性物质响应值呈现波动变化。不同处理方式的鱼片在不同时间响应值区域间距离明显，鱼片新鲜度差异显著(P<0.05)，表明利用LDA分析法能够区分对照组与保鲜剂组鱼片在不同贮藏时间的新鲜度。

图7 贮藏期间冷藏鱼片的负荷加载分析

图8 贮藏期间冷藏鱼片的PCA分析

图9 贮藏期间冷藏鱼片的LDA分析

2.7.4 特征雷达图分析 由图10可知，新鲜鳟鱼雷达图响应值分布均匀，表明鱼肉新鲜度良好；随着贮藏时间的延长，两组鱼片响应值开始发生变化，对照组中除R6、R8传感器响应值增大外，其余传感器响应值均逐渐减小；而保鲜剂组中除R2、R6及R7传感器响应值增大外，其余传感器响应值均减小。贮藏至第14天时，对照组与保鲜剂组鱼片的R2、R6、R7、R8传感器响应值增至最大，伴有明显的鱼腥味，已腐败变质，此时鱼肉挥发性气味主要由氮氧化合物、甲烷、芳香成分、乙醇等物质组成。

图10 贮藏期间冷藏鱼片的特征雷达图

3 结论

通过研究复合保鲜剂处理的虹鳟鱼片经真空包装后于4 ℃贮藏条件下的质构、理化指标及微生物指标变化情况，同时利用低场核磁共振及电子鼻技术对其进行快速检测，以此评价复合保鲜剂对鳟鱼的保鲜效果。结果表明，复合保鲜剂能较好地维持鱼片质构特性，同时能够有效延缓TBA值、TVB-N值及菌落总数变化。利用低场核磁测得两组鱼片贮藏期间T21幅值逐渐降低，贮藏后期(12～14 d)，保鲜剂组自由水比例显著低于对照组(P<0.05)，且两组鱼片自由水比例与初期比较均增加。通过电子鼻技术可较好地区分贮藏期间鱼片的品质变化，通过LA分析发现引起鱼片新鲜度变化的主要成分为氮氧化合物、无机硫化物、芳香成分物质和乙醇等，而PCA分析表明不同贮藏时间的鱼片与新鲜鱼片比较均存在一定距离，对照组鱼片第6天开始腐败变质，保鲜剂组鱼片第10天开始腐败。低场核磁及电子鼻检测结果与理化指标结果具有一致性，即证明低场核磁共振技术与电子鼻技术可用于虹鳟鱼片贮藏期间的快速无损检测；与对照组比较，复合保鲜剂能将鳟鱼片的贮藏期延长4 d左右。后续可深入探讨经不同贮藏温度、不同包装材料结合复合保鲜剂处理的虹鳟鱼片在贮藏过程中的品质变化。