拟南芥和水稻Cel基因家族的生物信息学分析

王丽珊

（闽西职业技术学院，福建 龙岩 364021）

纤维素是植物细胞壁的主要组成成分。纤维素酶解是将生物质原料转化为乙醇的一条高效的、无污染的关键途径。研究纤维素酶对解决世界粮食短缺、能源危机、环境污染等问题具有重要意义。植物合成的纤维素酶（Cellulase，Cel），通常也称内切-1,4-β-葡 聚 糖 酶 （endo-1,4-β-D-glucanases，EC 3.2.1.4），属于糖苷水解酶家族9（glycoside hydrolase family 9，GH9），在纤维素的合成和分解过程中起着重要的作用[1]。Hayashi等鉴定了25个拟南芥Cel基因和20个水稻Cel基因[2]。研究表明纤维素酶与拟南芥长角果开裂和杨树侧根生成有关[3-4]。目前已有多种植物Cel基因相继报道，但对双子叶植物拟南芥和单子叶植物水稻Cel基因的对比分析报道较少。本研究运用生物信息学的方法，对拟南芥和水稻Cel基因的基因结构、系统发育进化、蛋白质结构、跨膜结构、信号肽（signal peptide，SP）、亚细胞定位、结构域、保守基序进行预测和对比分析，以期为今后深入研究植物Cel基因家族的进化、结构特征和功能的多样性提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本文数据来自于拟南芥数据库TAIR、水稻数据库RGAP、碳水化合物活性酶数据库CAZY、植物信息资源网Phytozome、美国国立生物信息中心NCBI、欧洲分子生物学实验室EMBL。

1.2 方法

1.2.1 Cel基因家族成员的鉴定与分类、基因结构分析和系统进化树构建

以拟南芥和水稻Cel基因编码蛋白质序列为检索序列，利用BLAST工具进行同源搜索。运用软件Pfam、CDD、SMART等预测蛋白质的保守结构域，具有GH9催化结构域的蛋白质序列属于纤维素酶。将结构域特征进行比对分析后分类和命名。运用软件GSDS对Cel基因的染色体位置、基因结构、内含子和外显子位置和数量进行预测和分析。运用软件BioEdit、Clustal W、MEGA7．0 对蛋白质进行多重比对、聚类分析、构建系统发育进化树。

1.2.2 Cel基因家族成员蛋白质一级结构、二级结构、三级结构特性分析

运用软件PROTPARAM、PROTSCALE对Cel基因编码蛋白质的一级结构（氨基酸数目、分子量、理论等电点等）进行预测和分析。运用软件SOPMA对蛋白质的二级结构，如α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲等进行预测和分析。运用软件Swiss-Model对蛋白质三级结构进行同源建模，Swiss-PdbViever分析同源建模的结果，并构建拉氏图。拉氏图中二面角有90%以上位于允许区和最大允许区，则表明构建的空间构象是合理的。

1.2.3 Cel基因家族成员蛋白质的跨膜结构、信号肽、亚细胞定位、结构域、保守基序和多序列比对分析

运 用 软 件 TMHMM、SIGNALP、PSORT、Plant-PLoc对Cel基因编码蛋白质的跨膜结构、SP及亚细胞定位进行预测和分析。运用软件Pfam、CDD、SMART、Prosite对蛋白质的保守结构域进行预测和分析。运用软件MEME对蛋白质的保守基序进行预测和分析。运用Clustal W对蛋白质进行多序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 Cel基因家族成员的鉴定与分类、系统进化树和基因结构分析

从拟南芥和水稻数据库中分别搜索到各25个Cel基因，数目差别不大。Urbanowicz将GH9分为3个亚家族：GH9A、GH9B、GH9C[5]。GH9A 成员的蛋白质N端具有胞质结构域（cytosolic domain，CT）和跨膜结构域 （transmembrane domain，TM），C 端具有GH9催化结构域（catalytic domain,CD）。GH9B成员的蛋白质N端具有SP，C端具有CD。GH9C成员的蛋白质N端具有SP和CD，C端具有CBM和连接肽。参照该分类方法，对50个Cel基因进行分类和命名。拟南芥GH9A有4个成员，GH9B有18个成员，GH9C有3个成员；水稻GH9A有4个成员，GH9B有17个成员，GH9C有4个成员（表1，篇幅有限仅展示部分成员）。

由图1可知，系统进化树中拟南芥和水稻没有单独聚类形成各自的分支，而是相互交叉，3个亚家族没有明显地分为3大支。Cel基因分成4大类群：Ⅰ类群有21个成员，均是GH9B成员；Ⅱ类群有18个成员，是GH9B和GH9C成员；Ⅲ类群有6个成员，均是GH9A成员；Ⅳ类群有5个成员，均是GH9B成员。GH9B既能与GH9A聚成一支，又能与GH9C聚成一支。Cel基因家族中出现较多的旁系同源蛋白，其中GH9B旁系同源蛋白数量最多。拟南芥和水稻Cel基因结构差异很大，具有十分明显的多样性特征。拟南芥中，大部分Cel基因有3～7个内含子（92%）。水稻中，大部分Cel基因有2～6个内含子（88%）。GH9A成员的内含子数量多于GH9C成员。GH9A成员中，AtGH9A2和OsGH9A3发生了内含子丢失，其余Cel基因结构相似。GH9C成员中，OsGH9C1、OsGH9C2、OsGH9C4发生了内含子丢失，其余Cel基因结构相似。GH9B成员中，拟南芥和水稻的Cel基因结构差异较大。由表1可知，Cel基因在染色体上分布并不均匀。拟南芥中，第1号染色体上分布最多；水稻中，第2号染色体上分布最多。水稻的基因长度比拟南芥略长，但转录产物长度、编码基因长度和肽链氨基酸个数差别不大。

2.2 Cel基因家族成员蛋白质一级结构、二级结构、三级结构分析

由表1可知，Cel基因编码的蛋白质分子量相近， 拟南芥在 52．5～69．8kDa 之间， 水稻在 41．5～69．2kDa 之间（OsGH9C3 除外）。Cel基因编码的蛋白质的理论等电点（PI）大小不等，拟南芥PI最高为9．33，最低为 5．03；水稻 PI最高为 9．36，最低为 5．2。不稳定系数大于40为不稳定蛋白，小于40为稳定蛋白，大部分Cel基因编码的蛋白质为稳定蛋白（92%）。 亲水性指数介于-0．5～0．5 之间为两性蛋白质[6]，Cel基因编码的蛋白质均为两性蛋白质。Cel基因编码的蛋白质的二级结构基本相似（AtGH9B8和OsGH9C4除外），主要结构元件是无规则卷曲和α-螺旋，特征为无规则卷曲＞α-螺旋＞延伸链＞β-转角。Cel基因编码的蛋白质序列三级结构同源建模结果显示，α-螺旋和无规则卷曲是主要结构，拉氏图显示空间构象合理（图略）。

2.3 Cel基因家族成员蛋白质跨膜结构、信号肽及亚细胞定位分析

由表1可知，GH9A和GH9C成员均具有1个跨膜螺旋；GH9B大部分成员不具有跨膜螺旋（拟南芥67%、水稻59%）。GH9A成员均不具有SP（Os－GH9A4除外）；GH9C成员均具有SP（OsGH9C4除外）；GH9B大部分成员具有SP（拟南芥83%，水稻82%）。拟南芥和水稻的13个Cel基因编码的蛋白质亚细胞定位于细胞膜 （26%）、3个定位于细胞壁（6%）、34个定位于细胞膜或细胞壁（68%）。

2.4 Cel基因家族成员蛋白质的结构域、保守基序和多序列比对分析

由表1可知，Cel基因编码的蛋白质均有CD，大部分成员在CD内有1个DAGD氨基酸模块（92%）。其中OsGH9B17没有DAGD模块，AtGH9A2为DGGS模块，OsGH9B7、OsGH9C4为GSDG模块。GH9A成员的蛋白质N端均有TM （位于71~101氨基酸残基片段上），没有SP（OsGH9A4除外）；C端有脯氨酸富集区域 （最后16个氨基酸中有8~10个脯氨酸）。GH9B少部分成员具有TM，且位置不一样。GH9C成员的蛋白质N端均有TM （位于7~29的氨基酸残基片段上）和SP；C端均有纤维素结合结构域（CBM49）。GH9具有2个催化活性位点特征（active sites signature）：特征 1 具有[STV]-x-[LIVMFY]-[STV]-x（2）-G-x-[NKR]-x（4）-[PLIVM]-H-x-R 序列；特征 2 具有[FYW]-x-D-x（4）-[FYW]-x（3）-E-x-[STA]-x（3）-N-[STA]序列[5]。 19 个 Cel基因编码的蛋白质同时有催化活性位点特征1和2（38%）。大部分只有特征1的成员，有RGD模块。由图2可知，共鉴定出了25个保守基序（motif 1~25），这些保守基序形成了多样性和复杂性的组成模式。最大基序长度为49个氨基酸，最小基序长度仅为8个氨基酸。motif 1~19、motif 22出现在较多数Cel基因编码的蛋白质中，且出现在CD内。GH9A成员特有基序为 motif 20、motif 21、motif 23、motif 25。GH9C 成员特有基序为motif24。GH9B成员具有多样化的组成模式。保守结构域与模块预测的位置基本一致 （图略）。motif 2在微生物有发现，且较保守，通常第1个酪氨酸被色氨酸取代，其中DAGD模块可能与金属结合有关；motif 3和motif 9，只存在于植物的葡聚糖酶中，微生物中没有；motif 7在植物和微生物中均有；motif 1和motif 4分别是GH9的2个催化活性位点所在区域，且相对保守；motif 14是RGD模块所在区域；motif 21是脯氨酸富集区域；motif 24是CBM所在区域；motif 20是CT所在区域[5]。

图1 拟南芥和水稻Cel基因家族基因结构预测

3 讨论

利用现有的拟南芥和水稻生物信息资源，各鉴定出25个Cel基因，其数目上相差不大，说明Cel基因家族在不同植物中进化是相对保守的。从系统进化分析，拟南芥和水稻Cel基因没有单独聚类，说明在单双子叶植物分化前，Cel基因发生过大幅度扩张。Cel基因家族具有较多的旁系同源蛋白，说明在单双子叶植物分化后，Cel基因家族许多成员获得了新功能，同时产生许多假基因。其中GH9B旁系同源蛋白数量最多。3个亚家族没有明显地分为3大支，这可能与糖苷水解酶结构域的保守性有关。GH9B既能与GH9A聚为一支，又能与GH9C聚成一支，说明GH9B在结构上与GH9A和GH9C具有共同点（CD，SP），与结构域分析相吻合。

图2 拟南芥和水稻Cel基因家族保守模块预测

从基因结构看，拟南芥和水稻Cel基因在染色体上的分布比较散，基因结构差异大，说明Cel基因具有明显的多样性特征，有复杂的起源和进化历史。GH9A成员的内含子数量多于GH9C成员，说明GH9A成员在进化过程中插入不少内含子，使其功能更为特化，产生的时间较晚。由此推测，GH9C是GH9A和GH9B的祖先，GH9A属于进化过程中较新的亚家族。GH9A和GH9C成员中，拟南芥和水稻的Cel基因结构相似，说明在单子叶植物和双子叶植物中，GH9A和GH9C功能进化较保守。AtGH9A2、OsGH9A3是GH9A中较早出现的成员。OsGH9C1~2、OsGH9C4是GH9C中较早出现的成员，且都是水稻的Cel基因，表明单子叶植物的GH9C出现的时间较早。

从蛋白质结构看，拟南芥和水稻Cel基因编码的蛋白质分子量相近，理论等电点大小不等，均为两性蛋白，大部分成员为稳定蛋白质（82%），二级结构和三级结构基本相似，说明纤维素酶的结构与功能紧密相联。GH9A和GH9C成员均具有1个跨膜螺旋，GH9B大部分成员不具有跨膜螺旋，说明GH9A、GH9C全部成员和GH9B少部分成员，需要经跨膜转运锚定于生物膜，才能发挥生物学作用。GH9A成员均不具有SP，GH9C成员和GH9B大部分具有SP，说明GH9A成员均为非分泌蛋白，GH9C成员和GH9B大部分成员为分泌蛋白。亚细胞定位显示纤维素酶位于细胞膜或细胞壁，说明蛋白质合成后，需经过转运到达细胞膜或细胞壁后才能发挥催化作用。

从蛋白质结构域和保守基序看，纤维素酶蛋白质的结构域与保守基序位置一致。Cel基因编码的蛋白质均具有 CD，CD内有一个 DAGD模块（motif 2）。其中 OsGH9B7、OsGH9C4 为 GSDG 模块，因此推测GSDG模块可能只出现在单子叶植物中，这个位点上的基因突变是否对其功能造成影响，有待进一步研究。GH9A成员的蛋白质N端有TM和CT（motif 20），C 端有脯氨酸富集区（motif 21），这个特点与微生物的连接不同结构域的连接肽结构相似。GH9C成员的蛋白质N端均有TM和SP，C端均有纤维素结合结构域（CBM49，motif 24）。 GH9B 少部分成员具有TM。Cel基因家族少部分成员同时具有催化活性位点特征1和2（motif 1，motif 4）。只有特征1的大部分成员，其蛋白质都具有RGD模块（motif 20），推测与细胞附着有关[7-8]。 motif 23和motif 25的功能有待进一步研究分析。motif 20、motif 21、motif 23、motif24、motif 25 属于稀少基序，表现出不同亚家族特异性，说明这些保守基序可能参与亚家族蛋白功能的形成，是决定亚家族功能的关键保守基序。