微柱凝胶免疫分析诊断新生儿免疫性血小板减少症自身抗体的价值研究

王景顺

(漯河医学高等专科学校一附院(漯河市中心医院)输血科，河南 漯河 462000)

免疫性血小板减少症是由于机体免疫功能失调而导致的血小板破坏增加或血小板生成减少，免疫性血小板减少症包括原发性和继发性两种[1，2]。原发免疫性血小板减少症即特发性血小板减少性紫癜（idopathi thrombocytopenic purpura，ITP），即无明确病因且有抗体介导的血小板被机体巨噬细胞系统所破坏以及无明确病因血小板生成受抑制[2]。在血小板减少孕妇中，ITP约占4%，患有ITP的孕妇其免疫球蛋白G（IgG）能够形成自身抗体，而母体内的IgG自身抗体则能通过胎盘导致新生儿免疫性血小板减少症 （Neonatal immune thrombocytopenia，NITP）[3]。 在疾病的诊断以及疗效判定方面，血小板抗体检测具有着重要作用，目前主要报道的检测方法包括流式细胞仪（FCM）、简易致敏红细胞血小板血清学技术（SEPSA）、单克隆抗体特异性血小板抗原固定术（MAIPA）等，但是由于此类检测方法操作繁琐，设备以及成本要求高，因此无法在临床工作中得到广泛运用[4]。微柱凝胶免疫分析技术（MGIA）是近年来兴起的新的血小板抗体检测和交叉配型技术，目前已有相关报道显示[5]，MGIA在新生儿同种免疫性血小板减少症患儿血小板同种抗体检测中获得了良好的应用效果。本研究探讨分析MGIA技术诊断新生儿免疫性血小板减少症自身抗体的应用价值，现报告如下：

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年8月－2017年4月在我院出生诊断为血小板减少症的新生儿172例作为研究对象，入组172例患儿均符合《实用新生儿学》中新生儿血小板减少症相关诊断标准[5]，其外周血血小板计数均＜100×109/L。其中男97例、女75例，日龄 1d～30d，平均日龄（13.62±3.96）d，其中足月儿78例、早产儿94例。此外，选择20例在我院临床确诊的非免疫性血小板减少症新生儿作为对照，其中男12例、女 8例，日龄 3d～30d，平均日龄（14.52±4.18）d。 两组年龄在统计学上无差异。

1.2 试剂及仪器 微柱凝胶血小板抗体检测试剂盒购于长春博迅生物技术有限责任公司；FYQ型免疫微柱孵育器购于长春博速生物技术有限公司；TD－3A型血型血清学用离心机购于长春博迅生物技术有限公司；流式细胞仪（FACScalibur）及其相关试剂均购于美国BD公司。

1.3 MGIA法检测自身抗体 采集血小板减少患儿及自身抗体检测阳性患儿母体3～5ml外周血，将其置于EDTA抗凝离心管内，800r/min离心10min后分离部分血浆，使用剩余血浆悬浮压积血小板并将血小板浓度调节为（100±50）×109/L。将调节好浓度的血小板悬液贮存于塑料容器内待测将血小板抗体微柱凝胶检测卡分别设置样本、阴性对照、阳性对照，分别加入待测血浆、阴性对照试剂以及阳性对照试剂。参照试剂盒使用说明书，在样本孔内加入低例子强度盐溶液50μl、血小板悬液50μl、血小板指示红细胞25μl；在阴性对照微孔以及阳性对照微孔加入低离子强度盐溶液50μl、血小板广谱裂解抗原50μl、血小板指示红细胞25μl。将检测卡放置于免疫微柱孵育器中37℃孵育15min，然后使用专用离心机900r/min离心2min，1500r/min离心3min[6－9]。结果判断：红细胞凝集块位于凝胶表面或者凝胶中为阳性；红细胞完全沉降于凝胶管底部为阴性。

1.4 FCM法检测自身抗体 取血小板减少患儿（或母亲）全血 3ml，加入 0.109mol/L 枸橼酸钠 400μl，混匀后离心15min（790r/min）；取血浆加入1ml 2%PFA 后避光固定 15min，离心 5min（5000r/min）弃去上清液，加入2ml PBS混匀后离心5min（5000r/min）弃去上清液。根据血小板计数配置抗体，血小板计数 3×109/L 加入 1μl FITC－抗人 IgG，（4～5）×109/L 加入 1.5μl FITC－抗人 IgG，（5～7）×109/L 加入2μl FITC－抗人 IgG，＞7×109/L 加入 2.5μl FITC－抗人IgG。将1支上样管加入5μl浓血小板悬液以及10μl FITC－抗人IgG作为阳性对照，再取另外1支上样管加入5μl浓血小板悬液作为阴性对照组。将上述准备好的血小板混液放置避光处20min，加入0.5ml PBS 后上机 （SYSMEX－K4500 血细胞分析仪）检测。

1.6 统计学分析 采用统计学软件SPSS 22.0进行数据处理分析，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MGIA对非免疫性血小板减少症新生儿检查情况 MGIA对20例临床确诊的非免疫性血小板减少症新生儿检出结果均为阴性。

2.1 两种方法检测患儿血小板自身抗体 流式细胞仪法检出血小板减少症自身抗体患儿21例、检出阳性率为12.21%，微柱凝胶法检出血小板减少症自身抗体患儿20例、检出阳性率为11.63%，两组检出阳性率比较差异无统计学意义P＞0.05），见表1。

表1 两种方法检测患儿血小板自身抗体情况（例）

2.2 两种方法检测阳性患儿母亲血小板自身抗体检测阳性21例患儿母亲血小板自身抗体，微柱凝胶法检出母亲血小板自身抗体19例，检出阳性率90.48%，流式细胞仪技术检出母亲血小板自身抗体21例，检出阳性率100.00%，两种方法检测阳性患儿母亲血小板自身抗体检出阳性率无显著差异（P＞0.05），见表 2。

表2 两种方法检测阳性患儿母亲血小板自身抗体

3 讨论

引发新生儿血小板减少的原因主要包括获得性免疫性、药物性、感染性以及遗传性等，其中以获得性免疫性为主[10]。对于免疫性血小板减少症，目前国内外均无一项特异性的实验室检查手段能够对其确诊。在临床工作当中，众多的非免疫性血小板减少症患儿常常被临床误诊为免疫性血小板减少症，而基于免疫抑制剂、免疫球蛋白或糖皮质激素治疗，引发患儿发生严重并发症或给患儿家庭带来了不必要的经济损失[11]。因此对于新生儿免疫性血小板减少症的临床鉴别，对于指导临床治疗工作具有着重要的临床意义。

血小板自身抗体其产生机制目前尚未明确，血小板自身抗体可引起新生儿免疫性血小板减少症，血小板自身抗体为绝大部分的IgG以及少部分IgM，对于此类自身抗体的检测，目前常用的方法包括FCM、SEPSA、MAIP法，虽然准确率高，但检验步骤繁琐且设备要求高，而固相凝集法以及血小板免疫荧光试验等，由于新生儿不易获得放散所需的足够血小板，因此检测准确性不高[12－14]。流式细胞仪技术能够检测血小板相关抗体，在数秒时间内对上万个细胞进行计算，并对细胞表面的多参数进行分析，是新生儿免疫性血小板减少症诊断的一个重要手段，但是流式细胞仪技术设备要求高，检测成本较大。微柱凝胶法作为一种新型的血清检测技术，其主要工作原理为分子筛，当抗原抗体反应与凝胶分子筛相结合，检测时游离的红细胞能够自由穿过凝胶柱；而当抗原抗体反应出现凝集红细胞则由于体积过大则无法穿过凝胶柱上的分子筛，因此凝集的红细胞则悬浮在凝胶柱上，进而能够分别出游离红细胞以及凝集的红细胞[9]。此外，微柱凝胶法可在检测时将抗人球蛋白以及血型抗体提前放入检测孔，无需逐一加入相应的检测物，从而简化了检测步骤，降低人为因素的误差[15]。

本研究探讨分析微柱凝胶免疫法诊断新生儿免疫性血小板减少症临床价值，并于流式细胞技术检测结果相比较，结果显示，对于新生儿血小板减少症患儿自身抗体的检测，微柱凝胶法与流式细胞技术均无显著差异；此外，针对自身抗体检出阳性的患儿母亲进行自身抗体的检测，结果显示，微柱凝胶法检出母亲血小板自身抗体阳性率90.48%，流式细胞仪技术检出母亲血小板自身抗体阳性率100%，两种方法比较，检出阳性率无显著差异。表明微柱凝胶免疫法与流式细胞技术检测新生儿免疫性血小板减少症自身抗体无明显差异，而微柱凝胶免疫法其操作简单，有助于新生儿免疫性血小板减少症的临床鉴别及早期治疗方案的确定。此外，MGIA对20例临床确诊的非免疫性血小板减少症新生儿检出结果均为阴性。进一步提示MGIA对免疫性血小板减少症新生儿具有较高的特异性。