反义寡核苷酸处理伊马替尼耐药慢粒细胞后Bcl-x剪接异构体的变化

张静，李书琪，黄波，闵清华，姜钰环，杨伟明，徐颜美，林晋，刘静，王小中

(江西省检验医学重点实验室，南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌330006)

伊马替尼(Imatinib，IM)耐药是慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）治疗失败的主要原因之一，其耐药机制十分复杂。众多研究报道，基因异常剪接是肿瘤出现化疗抵抗的重要分子基础[1-3]。Bcl-x基因是Bcl-2家族成员之一，其pre-mRNA通过选择性剪接（alternative splicing）主要生成两种剪接异构体，Bcl-xL和Bcl-xS。Bcl-xL是重要的抗凋亡蛋白，而Bcl-xS则是重要的促凋亡蛋白，两者生物功能相互拮抗，表达处于平衡状态[4]。当Bcl-x基因的剪接发生异常时，Bcl-xL/BclxS比值显著升高，现已证实这是乳腺癌等[5，6]肿瘤发生、发展的关键分子事件。所谓vMO技术是近年发展起来的一种能实现体内、外直接调控靶基因选择性剪接的高效方法，与培养的细胞共同孵育能高效转运至胞内，也可以经静脉、腹腔注射到体内后能高效转运至全身各组织器官，与靶基因前mRNA的特定核苷酸序列结合，从而调控选择性剪接。2016年Nature杂志报道应用Vivo-Morpholinos（vMO）在小鼠体内靶向调控内含子剪接位点，为我们提供了成功调控选择性剪接的例证[7]。目前，运用vMO技术处理IM耐药CML细胞后，观察Bclx剪接异构体变化的研究尚未见相关报道，本研究有望为临床治疗CML及其他伴Bcl-x剪接异常的肿瘤的化疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 IM耐药CML细胞K562/G01（购自中国医学科学院天津血液研究所）。RMPI 1640培养基（Bioind）含10%FBS，青霉素和链霉素浓度均为100U/ml。Imatinib购自Sigma Aldrich公司，PrimeScriptTM RT Master Mix逆转录试剂盒（日本Takara 公司），2×Taq PCR Master Mix（北京全式金生物技术有限公司），Bcl－x抗体 （美国BD公司），β－actin抗体 （Proteintech中国分公司），vMO试剂盒（美国Gene Tools公司）

1.2 方法

1.2.1 vMO序列设计原理 我们检索相关文献发现，肿瘤细胞中调控Bcl－x基因外显子2b剪接的机制均为剪接增强调控，在Bcl－x基因的外显子2a、2b及内含子2中均存在相应的外显子增强子，使外显子2b的剪接得以增强，即促进Bcl－xL的形成，减少Bcl－xS的形成。反义寡核苷酸能通过与pre－mRNA上5’或3’剪接位点靶向结合从而阻止剪接体对该位点的识别，进而增加其他隐蔽剪接位点的使用，最终实现对基因的剪接调控。我们设计本项目的序列由Gene Tools公司合成。

1.2.2 总 RNA 提取及 Bcl－xL 和 Bcl－xS mRNA 表达水平检测 根据Bcl－x、GAPDH基因设计特异引物，引物序列见表1。

按照以下PCR扩增反应体系 2×Taq PCR Master Mix 10μl， 上下游引物各 1μl，cDNA 2μl及dH2O 6μl，总反应体积为20μl进行加样，点动混匀，离心后放入PCR扩增仪进行扩增，反应条件为：95℃ 5min；（95℃ 30s； 退火温度 （见表）35s；72℃ 30s）35 个循环；72℃延伸 5min；以 GAPDH 作为内参。反应结束后，取PCR产物10μl，进行2%琼脂糖凝胶电泳。利用BIO－RAO凝胶成像仪进行图像检测，并用其分析软件（Image Lab）进行定量分析。

1.2.3 Western－Blot检测 Bcl－xL 和 Bcl－xS 蛋白表达水平 细胞总蛋白提取和定量检测合格后，经SDS－PAGE电泳。孵育一抗：用一抗稀释液对一抗体进行稀释 （Bcl－x 稀释：1：4000； 内参稀释：1：1000），孵育二抗：用1×TBST或者封闭液稀释二抗（anti－rabbit：1：10000）， 将 PVDF 膜完全浸没于二抗液中，洗膜后暗室曝光拍照存图，利用BIO－RAO凝胶成像仪进行图像检测，并用其分析软件（Image Lab）进行定量分析，实验重复三次。

1.3 统计学方法 运用SPSS 23.0对实验数据进行统计学分析，正态计量数据以均数±标准差（x±s）形式表示，两组间比较采用t检验，多组采用方差分析，P＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 K562/G01细胞对Imatinib化疗耐受作用 取对数生长期的K562/G01细胞A、B、C，调整每孔细胞密度均（2～3）×105，依次向每孔加 2μM imatinib（根据天津血液研究所建议耐药细胞稳定生存用量）作用0，24h，48h，镜下观察到细胞形态几乎无变化，提示K562/G01细胞对imatinib出现抵抗（图1）。

图 1 K562/G01细胞对 imatinib抵抗 (A，B，C：K562/G01细胞2μM imatinib 作用 0，24，48h)

2.2 合成靶向Bcl－x剪接调控位点的特异性vMO我们设计的靶向调控Bcl－x选择性剪接的vMO序列如下：5′－GCTTGGTTCTTACCCAGCCGCCGTT－3′（下划线处为外显子2b和内含子2交界处），对应Bcl－x 基因序列为：5′－CAGGAG[AACGGCGGCTGG gta aga acc aag c]cc ctt gtg tgt c－3′（大写字母表示外显子序列，小写字母表示内含子序列，中括号内为互补结合区）。

2.3 vMO能稳定高效转染K562/G01细胞 如前文所述，我们初步设计合成了靶向调控Bcl－x选择性剪接的vMO序列，将3′端以荧光素FAM标记，于饱和湿度条件下37℃，5%CO2，10%小牛血清，RPMI 1640培养基与耐药CML细胞株K562/G01共孵育 24h，48h，72h，96h，使用 imatinib 浓度1μM，取细胞以PBS洗至无游离荧光于倒置显微镜观察，流式细胞仪检测胞内荧光强度，得出阳性百分率。结果显示48h大量细胞发荧光（图2.A），同时流式细胞术检测vMO转染K562/G01细胞阳性率达77.74%（图2.B），说明vMO在48h后能成功高效的转染目的细胞。

表1 PCR反应引物序列

图2 倒置荧光显微镜观察荧光标记vMO在48h转染K562/G01细胞（A），流式细胞仪检测48h胞内荧光强度（B）

2.4 vMO有效调节Bcl-xL/Bcl-xS mRNA比值 按照上述条件同时提取4个不同处理组细胞的RNA，经过逆转录、PCR扩增和琼脂糖电泳，最终在紫外灯下观察条带结果。PCR琼脂糖电泳条带显示：与单独IM和单独vMO组处理K562/G01细胞相比，IM+vMO组的Bcl-xL mRNA表达量显著降低，同时Bcl-xS mRNA表达量明显升高。Bcl-xL和Bcl-xS mRNA进行灰度值半定量分析，则BclxL/Bcl-xS比值下降更明显。见图3。

图3 vMO处理前后细胞胞内Bcl-xL和Bcl-xS mRNA比值的表达变化

2.5 vMO有效调节Bcl-xL/Bcl-xS蛋白比值 以相同的条件提取4个实验组细胞的总蛋白，按照上述相同条件提取4个不同处理组细胞的总蛋白，通过相关软件分析，经过蛋白电泳、转膜、孵抗体和曝光后，最终得到蛋白条带结果。Bcl-xL在vMO联合IM处理之后表达量明显降低，同时Bcl-xS表达量明显升高。说明，IM联合vMO转染K562/G01细胞影响Bcl-xL/Bcl-xS比值。见图4。

3 讨论

图4 Western blot检测不同处理组对Bcl-xL和Bcl-xS蛋白表达的影响

人类凋亡相关基因Bcl-x会通过选择性剪接产生Bcl-xL和Bcl-xS两种异构体，它们在维持细胞生存上分别起抑制或促进凋亡的作用。近年发现异常选择性剪接在多种不同类型白血病患者体内普遍存在，与白血病的发生、发展及化疗抵抗等密切相关[8]。研究报道，剪接体Bcl-xL在CML中高表达，其作用不是引发CML或维持CML状态，而是促进CML向加速期或急变期发展，并且可以提高CML细胞对TKIs等化疗药物的抗性[9]。另有研究证实，高浓度的Bcl-xL是维持CML干细胞生长的重要因素之一，而CML干细胞的增殖、衍变则是CML进展的根本和耐药的源泉[10]。本研究结果发现，Bcl-xL在IM耐药CML中高表达，而Bcl-xS显著低表达，提示Bcl-x基因异常选择性剪接是导致CML进展和化疗抵抗的关键分子基础，与文献报道一致。综合分析其机制主要涉及两个方面：一方面，Bcl-xL抗凋亡剪接体的过量表达能抑制化疗药物诱导的死亡受体和(或)线粒体凋亡通路的激活；另一方面，Bcl-xS促凋亡剪接体的表达水平和活性的降低，则能致正常浓度的化疗药物不能诱导凋亡信号的传播[11，12]。

vMO技术是一种能体内外直接调控靶基因选择性剪接的新方法。本研究在对CML的研究基础上，以耐药CML（K562/G01）细胞为模型，利用特殊设计的vMO技术与K562/G01细胞进行共培养，结果显示单独IM组和单独vMO租对K562/G01细胞Bcl-x基因选择性剪接模式的调控是有限的，产生此研究结果的可能原因是与耐药细胞中存在维持Bcl-x发生异常剪接的机制有关。IM药物作用的发挥在很大程度上是通过对细胞凋亡的诱导实现的，而在药物选择压力条件下，细胞可能通过抑制凋亡通路实现对IM耐受作用。因此，我们推测IM联合vMO在K562/G01中能有效纠正Bcl-x基因的剪接模式，这一变化可能与两者明显协同作用有关，进而激活凋亡相关信号通路，诱导耐药CML细胞凋亡，仍需后续实验进一步探讨。其调控机制是：当反义寡核苷酸靶向与Bcl-x基因外显子2b和内含子2交界处结合后，该5’剪接位点不能被剪接体识别，将迫使剪接体与外显子2a处5’剪接位点结合，最终导致外显子2b被切除，在减少Bcl-xL的生成的同时增加BclxS的生成，显著降低Bcl-xL/Bcl-xS比值，实现双向调控，这才是靶向Bcl-x基因治疗的最优策略。