应用RT-PCR-RFLP鉴别2014年新余市麻疹病毒感染病例

文奇 ，廖秀海 ，潘虹 ，胡传琛 ，龚甜 ，李健雄

(1.新余市疾病预防控制中心，江西 新余 338000；2.江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029)

麻疹是麻疹病毒引起的一种传染性很强的急性呼吸道疾病，在疫苗可预防的病毒性传染病中，麻疹的发病数和死亡数位居前列[1]。消除麻疹是全球共同致力于实现的目标[2]。中国大陆作为WHO西太区成员之一，自2006年开始实施消除麻疹行动计划和方案，通过落实含麻疹成分疫苗（Measles-containing Vaccine，MCV）接种、加强麻疹监测和疫情调查处置等综合消除措施，麻疹报告发病率自2009年逐年下降，而2012年之后却有所回升[3-5]，麻疹消除工作面临较大的挑战。加强MCV适龄儿童的基础免疫接种、开展特定人群的补充免疫活动（Supplementary Immunization Activity，SIA）仍是当前消除工作的首要任务。监测发现，少部分人在MCV接种后出现发热、出疹症状，这些病例究竟是疫苗相关麻疹病例还是偶合感染麻疹野病毒[6-8]，需要认真对待并加以区分。本文引进周剑惠、龚甜等人创建的麻疹疫苗株与野毒株鉴别方法[9，10]，用以鉴别新余市2014年部分麻疹确诊病例，现将有关分析情况进行报告。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2014年新余市辖区内共采集47例麻疹疑似病例咽拭子标本，市疾控中心对这些标本进行麻疹、风疹病毒核酸检测。选择8例麻疹病毒核酸检测阳性的病例标本作为研究对象，选择北京天坛生物公司的麻疹风疹联合减毒活疫苗（内含S191麻疹疫苗株，批号：201501007）作为阳性对照，各选取1例2014年麻疹和风疹病毒核酸检测均阴性、风疹核酸检测阳性的病例标本作为阴性对照，编号分别为M1409、M1424。

1.2 麻疹病毒RNA提取 根据Qiagen公司的RNeasy Mini Kit试剂盒 （Cat.No：74106，Lot No：145022097）说明书提取麻疹病毒RNA。

1.3 RT－PCR扩增麻疹病毒H基因 采用Qiagen公司 One Step RT－PCR Kit试剂盒(Cat：210212，Lot No：148047795)进行 RT－PCR 反应。上游引物：5′－CTCAATCGAGCATCAGGTCA－3′，下游引物：5′－TACATTCCCTGGGACGTCAT－3′。 RT 反应条件：60℃ 1min，42℃ 10min，50℃ 30min，95℃ 15min。PCR 循环如下：94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 60s，30 次循环，72℃ 10min，在 MJ Research PTC－200 仪器上进行扩增，扩增片段长度为438bp。

1.4 RFLP分析 每份RT－PCR产物均设立对照管和RFLP管，对照管为10μl的DNA产物，RFLP管为酶切产物，酶切反应体系是：Takara公司AflII限制 性 酶 （Lot No：1236A）1μl， 缓 冲 液 2μl，DNA 10μl，37℃下酶切 1h。麻疹疫苗株 （A基因型）被AflII酶切成287bp和151bp 2个片段，而麻疹野病毒（非A基因型）不能被酶切。

1.5 电泳 One Step RT－PCR扩增产物及其RFLP产物采用1.5%琼脂糖凝胶、北京六一产的DYY－6C型电泳仪电泳 1h，BIO－RAD公司 Universal HoodⅡ凝胶成像仪观察电泳结果。

2 结果

2.1 2014年新余市麻疹、风疹阳性病例特征 2014年新余市共检测47例麻疹疑似病例标本，检出麻疹核酸阳性11例、风疹核酸阳性2例。这些阳性病例中，男、女比例为 1.17：1；MCV 接种史情况如下：0次的有3例 （均为＜8月龄的婴儿），1次的有2例 （其中1例为首剂MCV接种第10d出疹的患儿，编号为M1415），2次的有1例，接种史不明的有7例（其中5例＞15岁）；＜8月的小月龄人群和＞15岁的大年龄人群的人数占总阳性病例数的61.5%（8/13）。

2.2 麻疹病毒H基因的RT－PCR－RFLP结果分析选取的新余市麻疹阳性标本 M1415、M1430、M1431、M1432、M1434、M1435、M1436、M1443 在AflII酶切前、后仅可见大小约438bp的RT－PCR产物 （未被酶切消化），2例阴性对照标本M1409、M1424均未出现扩增产物，而阳性对照S191麻疹疫苗株的RT－PCR产物可被酶切成大小约为287bp、151bp的两个片段（图 1），表明 2014年新余市被分析的8例麻疹病例（包括MCV首剂接种第10d出疹的患儿）均为麻疹野病毒感染所致。

图1 新余市2014年部分麻疹病毒H基因RT-PCR产物及其RFLP产物电泳图谱

3 讨论

目前我国儿童实行2剂次的MCV免疫程序，即8月龄接种第1剂（麻疹－风疹联合疫苗），18月龄～24月龄接种第2剂 （麻疹－流腮－风疹联合疫苗）[11]。MCV接种后若出现发热、出疹症状，存在以下三种情形：一是由于疫苗中微量的鸡胚细胞、小牛血清和抗生素等杂质引起的过敏反应，通常在接种后十几小时或几十小时内产生一过性皮疹[12，13]，大约有 2%的受种者出现此类反应[14，15]；二是人工感染，疫苗中的减毒活病毒在机体内复制、产生免疫应答而形成的疫苗相关病例[16]，一般发生在接种后1～2周内[17]，多见于首次接种MCV的婴儿[18]；三是偶合感染麻疹野病毒或其他发热出疹性疾病，在接种疫苗时已处在发病的潜伏期[18]。在麻疹消除工作的关键时期，如何从病原学方面鉴别MCV受种者感染的麻疹病毒是疫苗株还是野生株，是个值得深究的课题。

基因序列分析无疑是最准确、可靠的方法，但在基层实验室受条件所限，只能将标本外送测序，不仅费时费力，而且代价昂贵，难以大范围推广运用。周建惠等人受到Mori的启发[19]，建立了利用RT－PCR－RFLP方法来鉴别中国麻疹病毒疫苗株与野生株的检测技术。她们在研究中国麻疹病毒疫苗株与23种野生代表株的基因差异后，发现疫苗株H基因7666bp～7671bp上存在AflII酶切位点（CTTAAG），其长度为438bp的目的扩增片段可被AflII酶切成287bp、151bp的2个片段，23种野生株在相应位置均无AflII酶切位点却不被酶切消化，借此区分麻疹病毒疫苗株与野生株。相比于序列分析，RT－PCR－RFLP方法简便、快速，更具经济实用性，非常适合基层实验室使用。

在江西省疾控中心疾检所工作人员的协助下，我们成功引进并验证了上述麻疹病毒的RT－PCR－RFLP鉴别技术。疫苗株S191的扩增产物被AflII酶切成大小约为287bp、151bp的2个片段，2例麻疹阴性标本 （含1例风疹阳性标本）未被扩增，8例待分析的麻疹阳性病例标本成功得到扩增但不被AflII酶所消化，说明8例麻疹阳性病例均由麻疹野病毒所引起的，这与我省宜春市的报道相一致[20]；M1415患儿在MCV接种时已偶合感染麻疹野病毒，不属于疫苗相关病例。另外通过对新余市2014年麻疹、风疹病例信息进行分析，我们发现这些阳性病例几乎不体现出性别差异，年龄分布呈“双向移位”趋势，主要是＜8月的婴儿和＞15岁的人群，原因是＜8月的婴儿尚未接种疫苗，而＞15岁的人群常为无MCV接种史。