促胰岛β细胞增生的黄酮类化合物的活体筛选

王冲，林春雨，吴志强，李明玉

(1.中国海洋大学海洋生命学院，山东 青岛 266003；2.厦门大学药学院，福建 厦门 361102)

随着天然药物相关技术的发展，越来越多的天然药物被人们所发现，由此带来的对其活性进行筛选的需求也随之增加。传统意义上的药物筛选，通常是基于分子靶点和细胞表型分析进行的药物筛选[1]。但是这种体外筛选的方式并不能直接反应药物在体内的作用效果。近年来，随着药物筛选的发展，越来越多的以小型动物，如：秀丽线虫、果蝇、斑马鱼、非洲爪蟾为模型进行体内药物筛选的方式正快速发展[2-3]。这种将药物直接作用于个体水平的筛选方式，不仅能够直接反应出药物对生物体的毒性影响，而且能够更加全面地反应出药物对整个生物体的影响[4-6]。由于斑马鱼具有众多适合药物筛选应用的优点，如：胚胎透明、便于观察；繁殖率高、成本较低；体型较小、便于操作等。因此，以斑马鱼为模型进行药物筛选正得到越来越广泛的应用[6-7]。

本文利用斑马鱼的这一特点，以斑马鱼为模型进行黄酮类化合物的药物筛选。黄酮类化合物是以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物，广泛分布于各种植物组织中，如：荷叶、蒲公英、金银花叶、橘皮、竹叶等[8]。在植物体内，黄酮类化合物通常与糖类结合形成苷类化合物。据报道，黄酮类具有多种医药学功能，如降压、降糖、降血脂、抗氧化等[9-12]，但具体的机理尚不清楚。

本文主要探究黄酮类药物的降糖功效与胰腺β细胞数量之间的相互关系。糖尿病以1型和2型为主，1型糖尿病是自体免疫性疾病，由自体免疫系统破坏产生胰岛素的β-细胞引起的[13]。2型糖尿病主要由胰岛素抵抗及胰岛素相对缺乏引起的[14]。这两种糖尿病的最终发病都会引起胰岛β-细胞数量减少或者功能损伤，从而降低胰岛素的分泌[15]。而寻找促进胰岛β-细胞增生的药物，以期用在糖尿病治疗上一直是科学领域的研究热点[16]。本文采用β-细胞特异性表达mCherry的转基因斑马鱼Tg(-1.2ins:H2BmCherry)为模型，进行黄酮类化合物促β-细胞增生的活性筛选。并通过指示β-细胞复制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)][17]，以及指示β-细胞分化的模型TgBAC(neurod:eGFP)[18]进行进一步分析。整个筛选操作简单，方法便捷高效，可为黄酮类药物在糖尿病领域的进一步开发提供理论基础。

1 仪器、实验试剂以及实验动物

1.1 仪器 电子天平(舜宇恒平仪器)；体式荧光显微镜Leica M165FC(莱卡公司)；正置荧光显微镜AXIO IMAGER AI (蔡司公司)；共聚焦显微镜Zeiss LSM5(蔡司公司)。

1.2 实验试剂 二甲基亚砜(DMSO，生工，批号：D807BA001)；泼尼松龙(MCE ，批号：50-24-8)；磷酸缓冲液(10X PBS，BBI 生命科技，批号：EB12FA0001)； 羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES，Thermo fisher，批号：15630080)； 多聚甲醛(PFA，生工，批号：D606BA0003)； 间氨基苯甲酸乙酯(Sigma公司，批号：MKBX0252V)； 黄酮类药物(成都植标化纯生物技术有限公司)； Amplex Red 试剂盒 (Invitrogen A12222)。

1.3 实验动物 野生型斑马鱼(AB); Tg(-1.2ins:H2BmCherry)转基因斑马鱼; TgBAC(neurod:eGFP) 转基因斑马鱼; Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]转基因斑马鱼。

2 实验方法

2.1 实验动物-斑马鱼的养殖以及鱼卵的收集培养

2.1.1 斑马鱼的饲养 斑马鱼的饲养是按照标准的饲养方法：每天3次投喂颗粒饲料，早晚各喂养一次丰年虫卵，并给予适宜的光照(光照∶黑暗=14∶10)和温度(25 ℃)，并利用碱泵和盐泵调节适宜的pH(pH为7左右)和电导率(电导率为500左右)进行培养。

2.2.2 鱼卵的收集及培养 在夜间避光环境下将一雌一雄的斑马鱼共同放置在同一配鱼缸里，第二天白天光照的刺激下，收集沉落在配鱼缸缸底的受精卵。将其放置在鱼卵培养箱中培养5～6 d，培养箱中的温度维持在28.5 ℃，光照∶黑暗的时间比为14∶10。在培养期间，每天都应更换新鲜的斑马鱼水溶液，以维持斑马鱼生活环境的清洁。

2.2 斑马鱼的药物处理 转基因斑马鱼Tg(-1.2ins:H2BmCherry)、Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]、TgBAC(neurod:eGFP)产生的胚胎发育至第5天，转移至24孔板中，将每一孔中加入2 mL的斑马鱼水溶液、10条鱼和2 μL的药物(终浓度为10 μmol·L-1),并处理24 h。药物处理时，以 DMSO为空白对照组，以泼尼松龙(Prednisolone，10 μmol·L-1)为阳性对照组。

2.3 斑马鱼的固定、胰岛β细胞的成像和计数 药物处理过斑马鱼胚胎用4% PFA进行过夜固定。固定好的斑马鱼胚胎，转移至载玻片上，并使右侧朝上，在其上面滴加适量封片剂进行封片。封片完毕后，利用斑马鱼自身的胰岛β细胞所带有的荧光蛋白进行共聚焦显微成像和细胞数量统计。

2.4 斑马鱼血糖含量的测定 利用Amplex Red 试剂盒测定斑马鱼幼鱼的葡萄糖含量。每10条鱼匀浆于100 μL的缓冲液中，然后利用离心的方法清除匀浆。按照试剂盒的要求，每10 μL的上层清液就等同于一条幼鱼，对每条鱼的血糖进行测量。室温下孵育30 min。然后通过酶标仪测量其荧光值，设置的波长分别为：激发光：520 nm，发射光：580～640 nm。药物处理时，以 DMSO为空白对照组，以罗格列酮(RGZ,10 μmol·L-1)为阳性对照组。每一组应做3个重复。

3 实验结果

3.1 黄酮类化合物对斑马鱼胰岛β细胞的增生作用分析 我们选取了11种不同的黄酮类化合物，包括脱水淫羊藿素、淫羊藿素、香叶木素、柳穿鱼黄素、高黄芩素(野黄芩素)、甘草查尔酮C、芫花素、羟基芫花素、穗花杉双黄酮、洋艾素和银杏双黄酮。利用Tg(-1.2ins:H2BmCherry)斑马鱼胚胎，对这些化合物进行筛选。结果发现，对照组的β细胞为(32.67±1.922)，泼尼松龙作为阳性药物，也能够增加β细胞的数量。而黄酮类化合物中，柳穿鱼黄素、脱水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和银杏双黄酮与空白对照DMSO相比，能够增加红色胰岛β细胞的数量，分别为(37.60±1.951)、(37.53±1.786)、(45.00±2.714)、(33.77 ±2.612)和(37.33±2.762)(见图1～2)。我们选取高于DMSO组的化合物进行下一步分析。

A.空白对照;B.柳穿鱼黄素;C.脱水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香叶木素;F.高黄芩素(野黄芩素);G.甘草查尔酮C;H.芫花素;I.羟基芫花素;J.穗花杉双酮;K.洋艾素;L.银杏双黄酮;M.阳性对照；与空白对照组比较，**P<0.01图1 黄酮类化合物对斑马鱼胰岛β细胞增生作用的筛选

A.空白对照;B.柳穿鱼黄素;C.脱水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.阳性对照图2 黄酮类化合物对斑马鱼胰岛β细胞增生作用共聚焦拍摄图

3.2 黄酮类化合物对斑马鱼胰岛β细胞的复制作用分析 由于胰岛β细胞的增生的来源之一为已有的β细胞的复制。我们选取了5个促进β细胞增生的黄酮类化合物，并利用指示β-细胞复制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]进行分析。在该模型中，胰岛β-细胞特异性表达S/G2/M期的特异性蛋白Geminin，并以mAG(monomeric Azami green)-Geminin 融合蛋白的形式展现，经过复制的细胞会表达绿色荧光[16]。药物处理24 h后，结果发现，与空白对照组相比，淫羊藿素和阳性药泼尼松龙能够促进绿色β细胞的复制，数量分别为：(2.750±0.491 0)和(5.636±0.855 7)，高于对照组的(1.556±0.242 2)(见图3～4)。

A.空白对照;B.柳穿鱼黄素;C.脱水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香叶木素;F.高黄芩素(野黄芩素);G.阳性对照；与空白对照组比较，*P<0.05，***P<0.001图3 黄酮类化合物对斑马鱼胰岛β细胞复制的作用分析

A.空白对照;B.柳穿鱼黄素;C.脱水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.阳性对照图4 黄酮类化合物对斑马鱼胰岛β细胞复制的作用共聚焦拍摄图

这些结果表明，在这些黄酮类药物中，柳穿鱼黄素、脱水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和银杏双黄酮能够增加β细胞的数量。而淫羊藿素促进β细胞的增加部分来源于β细胞自身的复制。

3.3 黄酮类化合物对斑马鱼胰岛β细胞的分化作用分析 由于胰岛β细胞增生的另一来源为胰岛前体细胞分化为成熟β细胞。我们选取了促进5个β细胞增生的黄酮类化合物，并利用指示β-细胞分化的模型TgBAC(neurod:eGFP)进行分析。在该模型中，neurod是胰岛前体细胞的标记基因之一，来源于前体细胞的新β-细胞将表达eGFP绿色荧光[18]。柳穿鱼黄素、脱水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和银杏双黄酮等药物对TgBAC(neurod:eGFP)处理24 h后，我们统计了诱导分化的β细胞的数量。结果发现，与空白对照组相比，柳穿鱼黄素能够促进β细胞的分化，数量分别为(5.667±0.881 9)，高于对照组的(3.000±0.577 4)(图5～6)。

A.空白对照;B.柳穿鱼黄素;C.脱水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香叶木素;F.高黄芩素(野黄芩素);G.泼尼松龙图5 黄酮类化合物对斑马鱼β细胞分化作用的分析

A.空白对照;B.柳穿鱼黄素;C.脱水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香叶木素;F.高黄芩素(野黄芩素);G.泼尼松龙图6 黄酮类化合物对斑马鱼β细胞分化作用的分析共聚焦拍摄图

3.4 黄酮类化合物对斑马鱼血糖水平的统计分析 由于脱水淫羊藿素、淫羊藿素、柳穿鱼黄素、芫花素、银杏双黄酮、泼尼松龙能促进β细胞数量的增加，因此我们还进一步对药物处理的斑马鱼进行血糖水平的测量。结果发现柳穿鱼黄素、脱水淫羊藿素、淫羊藿素都能够降低斑马鱼的血糖，血糖值分别为：(153.5±2.202)、(171.2±12.25)、(171.6±6.978)pmol，明显低于空白对照组的(288.1±22.58)pmol。这些结果说明，这几种黄酮类药物具有降低血糖的作用(见图7)。

A.空白对照;B.柳穿鱼黄素;C.脱水淫羊藿素;D.淫羊藿素;E.香叶木素;F.高黄芩素(野黄芩素);G.泼尼松龙;H.阳性对照；与空白对照组比较，*P<0.05,**P<0.01图7 黄酮类化合物对斑马鱼血糖水平的影响分析

4 分析与讨论

本文以斑马鱼为模型进行黄酮类化合物的药物筛选，以期寻找到能够促进胰岛β细胞增生的药物。这些研究结果为将来开发黄酮类化合物用于糖尿病的治疗提供了参考依据。在以β细胞数量为指标的筛选过程中，我们发现柳穿鱼黄素、脱水淫羊藿素、淫羊藿素、芫花素和银杏双黄酮共5种黄酮类化合物能够促进胰岛β细胞的增生。为进一步分析这些增生的胰岛β细胞是通过复制还是分化而来，我们进行了进一步的探究。我们分别利用指示β-细胞复制的模型Tg[ins:mAG-zGeminin(1/100)]和指示β-细胞分化的模型TgBAC(neurod:EGFP)，对促进β细胞增生的化合物进行药物处理。结果发现，淫羊藿素能够诱导β-细胞的复制，但并不能诱导前体细胞的分化，说明了淫羊藿素促进β-细胞的增加部分来源于自身的细胞复制。当然，它促进增生的β-细胞的数量大于复制增加的细胞数量，说明还有一些其他的机制参与β-细胞数量的增加。而柳穿鱼黄素促进通过诱导分化增加的β-细胞的数量与增生的数量大致相同，说明其促进β-细胞的增生主要归功于诱导前体细胞的分化。

由于胰岛β细胞的增加可能会引起胰岛素分泌的增加，从而可能起到降低血糖的作用。我们在分析化合物对血糖水平影响的分析中发现，这些有3个促进β-细胞增生的黄酮类化合物在不同程度上都能起到降低血糖的作用。但是由于斑马鱼血糖水平的调节受到多种信号通路的影响，这些能够促进β细胞数量增加的药物是如何参与血糖水平的调控，还需进一步的研究。