HPLC同时测定疏清口服液中甘草素、甘草酸铵含量

文瑾，杨海宁,车宏伟,张宇佳，郑稳生

(1.中国药学会，北京 100022；2.中国医学科学院药物研究所，药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室，北京 100050)

疏清口服液是由甘草、芦根、桑叶、大青叶和石膏组成的复方制剂，具有清热解毒，宣泄肺胃的功效，主要用于小儿急性上呼吸道感染属风热证。疏清口服液由疏清颗粒更改剂型而来，疏清颗粒的生产厂家为吉林华康药业股份有限公司，由于疏清颗粒味苦、服用量大，限制了其在儿童中的应用，公司在调研中发现口服液更适宜儿童服用，遂在原方基础上设计制成疏清口服溶液剂，该项目受到“十三五重大新药创制”项目的支持。在试验研究前期主要采用大青叶中主要成分靛玉红作为浸膏的质量控制制标[1]，但是该指标不能反应药品的整体质量，因此需要对其他药材进行检测。甘草又名蜜甘、甜草、美草等，是我国常用的大宗药材，常作为佐使药应用于中药方剂，有“中草药之王”的美誉，具有益气补脾、清热解毒、止咳祛痰、缓急止痛、调和诸药等功效[2-4]，是疏清口服液重要的组成部分。本试验采用高效液相色谱(HPLC)法同时测定甘草中有效成分甘草素、甘草酸铵的含量，以至于更好地控制疏清口服液的质量，更好地为儿童用药发展服务。

1 仪器与试药

1.1 仪器 日立Chromaster 5430液相(Hitachi)；色谱柱Agilent Zorbax SB- C18(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)；XS105DU型电子天平(梅特勒)；DTC-27型超声波清洗机(鼎泰生化科技设备制造有限公司)；循环水式多用真空泵SHB-Ⅲ (北京神泰伟业仪器设备有限公司)。

1.2 试药 甘草酸单铵盐(批号：X4860010，上海安谱实验科技股份有限公司)；甘草素(E1315081，Aladdin)；乙腈(批号：G2781296，上海安谱实验科技股份有限公司)；甲醇(批号：175167，Fisher)；磷酸(批号：20151008，北京化工厂)；疏清口服液为本实验室自制样品(批号：20180314、20180417、20180426、20180512、20180527)，娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Zorbax SB- C18(4.6 mm×150 mm，3.5μm)；以0.1%的磷酸作为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱程序:0～14 min A相的比例保持84%，14～19 min，A 相的比例由84%降至50%，19～50 min A相的比例由50%降至0%；流速1.0 mL·min-1；柱温35 ℃;波长237 nm;进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品制备 精密称定甘草素、甘草酸铵适量于量瓶中，加75%甲醇超声溶解，放置至室温加甲醇定容至刻度配成甘草素、甘草酸铵(浓度分别为:128.0、821.6 μg·mL-1)的混合对照品储备液。取1 mL混合对照品储备液于10 mL量瓶中加75%的甲醇定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。放置于4 ℃冰箱保存，临用时放置至室温。

2.1.2 供试品的制备 称取处方量大青叶、芦根、甘草、桑叶四味药材加75%的甲醇室温浸渍72 h，渗漉，收集渗滤液及药渣，渗滤液减压浓缩至一定密度的清膏。另取药材石膏加水先煎20 min，后加入醇提药渣煎煮2次，每次45 min，采用纱布滤过，合并滤液，浓缩至一定密度清膏，合并上述两清膏，4 000 rpm离心45 min，加入矫味剂、防腐剂，定容至刻度，灭菌，即制备完成。精密移取制备完成的疏清疏清口服液1 mL于25 mL量瓶中，加75%甲醇超声30 min使溶解，放置至室温后加75%甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm有机膜滤过，即得供试品溶液。

2.1.3 阴性对照制备 取除甘草外的其余处方药材按照“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制备成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性考察 各精密吸取供试品溶液、对照品溶液与阴性对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果显示阴性对照品溶液的色谱在与甘草素、甘草酸对照品保留时间处无色谱峰出现，说明阴性对照无干扰，具体色谱图详见图1。

A

B

CA.对照组;B.供试品；C.阴性对照图1 HPLC谱图

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下对照品储备液0.2、0.5、1、2、8 mL分别置于10 mL量瓶中，超声使溶解，放置至室温加75%甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm有机膜滤过，精密吸取上述各溶液10 μL进样。以甘草素和甘草酸铵的标准质量浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)进行回归分析，结果显示甘草素回归方程为：Y=6×106X-0.168 3(R2=1)，结果表明在2.56～102.40 μg·mL-1范围内甘草素的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。甘草酸铵回归方程为：Y=1×106X-31 122(R2=0.999 7)，结果表明在16.43～657.28 μg·mL-1范围内甘草酸铵的峰面积与质量浓度呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度考察 精密吸取上述混合对照品溶液各10 μL，按照“2.1”项下色谱条件注入高效液相色谱仪，各重复进样6次，记录色谱图。结果甘草素、甘草酸铵的峰面积RSD值分别为0.20%、0.37%，表明该色谱方法精密度良好。

2.3.4 加样回收率试验 精密吸取已知含量的疏清口服液6份(批号：20180512)各0.5 mL，加入约相当于0.5 mL样品中甘草素和甘草酸铵含有量的对照品溶液，照“2.1.2”项下方法同法制备供试品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定记录峰面积，分别计算回收率及RSD值，结果详见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.3.5 稳定性试验 精密吸取对照品溶液于0、2、4、8、10、24 h 分别注入高效液相色谱仪，记录甘草素、甘草酸铵的峰面积，结果显示24 h内两物质峰面积的RSD值分别为1.08%、1.53%，结果表明采用甲醇提取供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验 分别精密吸取同一批次(20180512)疏清口服液6份，每份1 mL，采用“2.3”项下供试品的制备方法制备6份供试品溶液，精密吸取供试品试液各10 μL注入高效液相色谱仪，记录甘草酸铵与甘草素色谱峰面积，记录含量结果，供试品中甘草素含量为374.37 μg·mL-1(RSD=1.3%)，甘草酸铵为2.44 mg·mL-1(RSD=2.3%)，结果表明使用本方法测定甘草酸铵，甘草素含量重复性良好。

2.3.7 5批疏清口服液中甘草素、甘草酸铵含量 按照上述液相方法检测近期制备的5批疏清口服液中甘草素与甘草酸铵的含量，验证试验工艺的稳定性。结果如表2所示。

表2 5批疏清口服液中甘草素、甘草酸铵含量

3 讨论

疏清口服液主要用于治疗小儿感冒、发烧、咽痛、咳嗽等症，其中包含的五味药材相互作用，共同发挥疗效。其中甘草作为使药，起到调和诸药，扶正祛邪的功效，是方剂的重要组成部分。甘草最早记载于《神农本草经》，列为上品[5]，其除药用外还可以用于日常保健、化妆品、烟草等领域，陶弘景在《名医别录》中称甘草为众药之王，且经方少有不用者[6-7]。甘草中主要包括甘草素、异甘草素和新异甘草苷等黄酮类成分，甘草酸、甘草次酸和甘草甜素等皂苷类成分、生物碱和多糖等成分[8-9]，现代药理学研究表明[10]甘草具有抗炎、抗病毒、抗氧化、镇咳、抗癌等多种药理作用。在试验中发现疏清口服液中甘草有效成分甘草素、甘草酸铵含量较高，因此选择这两种成分作为检测指标。

本文考察了甲醇、75%甲醇、75%乙醇3种不同提取溶剂及不同提取溶剂不同体积(25、50、100 mL)对甘草素和甘草酸铵的提取效率，结果显示75%的甲醇提取甘草酸铵的效率更高，提取溶剂的体积对结果无影响。试验中还考察了超声时间对提取效果的影响，结果显示超声30 min即可将口服液中甘草素及甘草酸铵提取完全。

试验考察了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-磷酸-水作为流动相进行梯度洗脱，以甲醇-水作为流动相时分离效果不好，乙腈-水可以很好地分离各个物质但是峰形对称性不好，最终采用乙腈-磷酸-水系统作为流动相，其重复性好，分离效果好，灵敏度高，可以用于甘草素、甘草酸铵的含量测定。在波长选择方面甘草素的最佳吸收波长为213 nm，甘草酸铵最大吸收波长为250 nm，结合DAD全波长扫描3D谱图，选择237 nm作为最佳检测波长。

由于疏清口服液采用的是醇提与水提结合的两步提取法，提取浓缩过程中工艺些许变化可能都会对口服液的质量造成一定的影响，因此每批口服液中甘草素与甘草酸铵的量可能会略有差异。

综上所述本文建立的采用高效液相色谱法同时测定疏清口服液中甘草素、甘草酸铵的含量测定，方法具有灵敏度高，重复性好，操作简单等优点，可以为疏清口服液的质量标准的建立提供参考。