伏立康唑与布地奈德联用抗白色念珠菌的作用研究

郝丽娜，陈小雪，李秀云

(1.山东大学齐鲁儿童医院，山东 济南 250022；2.青岛大学附属医院，山东 青岛 266000)

白色念珠菌耐药性的出现给临床抗感染带来极大挑战[1-2]。联合用药抗耐药真菌是近年来的国际研究热点[3]。伏立康唑作为新一代三唑类抗真菌药，已成为治疗白色念珠菌感染的一线药物[4]。在患者重症感染时，布地奈德与抗真菌药物有联合应用机会。本研究旨在借助大蜡螟感染模型、微量稀释法测定两药联用的体内、外抗白色念珠菌作用。

1 材料

1.1 菌株 实验菌株：敏感白色念珠菌2株(CA4、CA8)和耐药白色念珠菌2株(CA10、CA16)，山东省千佛山医院临床分离。质控菌株：白色念珠菌(ATCC10231)，山东大学药学院药理实验室惠赠。

1.2 药品与主要试剂 伏立康唑(大连美仑生物技术有限公司)；布地奈德(美仑生物技术有限公司)；苯唑西林钠(大连美仑生物技术有限公司)；RPMI1640药粉(北京拜耳生物技术有限公司)；3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸(MOPS，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，北京欣华绿源科技有限公司)；PAS染色试剂盒(烟台赛尔斯生物技术有限公司)；3，3′-[1-(苯氨酰基)-3，4-四氮唑]-二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT，美国Sigma公司)。

1.3 昆虫感染模型 大蜡螟适龄幼虫(天津惠裕德生物科技有限公司)。

1.4 仪器 G-560E涡旋混合器(美国Si公司)；超净工作台(新加坡ESCO公司)；恒温培养箱(德国MMM公司)；SpectraMax190酶标仪(美国Molecular Devices公司)；Olympus FSX100荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)；Leica CM1950冰冻切片机(德国徕卡公司)；50 μL微量注射器(上海高鸽有限公司)。

2 实验方法

2.1 体外作用测定 根据美国临床实验室标准化协会的标准方法(CLSI，2008 M27-A3)，通过微量稀释法测定伏立康唑与布地奈德联用抗4株白色念珠菌(CA4、CA8、CA10、CA16)的体外作用。经 RPMI1640液体培养基稀释后的不同浓度的两个药物被分别加到96孔微量稀释平板的不同微孔中，每个微孔中的菌液终浓度为2×103cfu·mL-1(96孔微量稀释平板的第12列只加RPMI 1640液体培养基，作为阴性对照)。96孔微量稀释平板于35 ℃恒温箱中孵育24 h后，加入XTT继续孵育2 h。经培养后，使用酶标仪(492 nm)读取各孔OD值。与无药物干预孔内真菌生长率比较，以抑制80%真菌生长的最低药物浓度为MIC，使用FICI模型和△E模型共同评价伏立康唑和布地奈德联用的体外抗白色念珠菌作用。

FICI模型的计算和判读标准[5]：FICI=联用时A药的MIC/单用时A药的MIC+联用时B药的MIC/单用时B药的MIC(协同作用：FICI≤0.5，拮抗作用：FICI>4，无关作用：0.5

△E模型的计算和判读标准[6]：△E=EA×EB-E联用，其中，伏立康唑与布地奈德单用时白色念珠菌的生长率分别是EA和EB，联用时白色念珠菌的生长率为E联用。

通过 ΣSYN(96孔板中所有正值△E的加和)与 ΣANT(96孔板中所有负值△E的加和)的加和指标来判断两药的相互作用。当 ΣSYN(正值△E之总和)与 ΣANT(负值△E之总和)相加为正值时，表示伏立康唑与布地奈德对白色念珠菌有协同作用，为负值时，表示伏立康唑与布地奈德对白色念珠菌有拮抗作用(弱的拮抗或协同作用：|ΣSYN+ΣANT|<100%时，中等的拮抗或协同作用：100%≤|ΣSYN+ΣANT|≤200%，强的拮抗或协同作用：|ΣSYN+ΣANT|>200%)。所有实验在相同实验条件下重复3次。

2.2 体内作用测定 分别用PBS将适量对数生长期敏感白色念珠菌(CA4)和耐药白色念珠菌(CA10)真菌细胞配制成终浓度为5×108cfu·mL-1的工作菌液，伏立康唑和布地奈德的终浓度均为160 μg·mL-1。为预防大蜡螟因感染细菌而影响本次试验，随后向配好的白色念珠菌菌液中加入终浓度为2 μg·mL-1的苯唑西林钠。随机选取大蜡螟幼虫[(0.2±0.02) g]若干只，将其按照随机分组原则分为4组(对照组、伏立康唑、布地奈德、伏立康唑+布地奈德)，将其放在无菌培养皿中，各组16只。使用微量进样针通过虫体的腹足注射10 μL上述菌液，35 ℃培养2～2.5 h使白色念珠菌侵染大蜡螟，再次通过虫体的另一腹足注射10 μL相应的PBS或药液。接种后，置于35 ℃黑暗环境中培养。

2.2.1 大蜡螟生存分析 每组选取16只适龄大蜡螟幼虫，实验步骤同“2.2”项下。培养期间，每天对各组存活幼虫进行计数，共持续观察4 d。所有实验重复3次。用SPSS 19.0软件进行统计分析。

2.2.2 真菌载菌量的测定 每组选取16只适龄大蜡螟幼虫，实验步骤同“2.2”项下。培养期间，每24 h从各组幼虫中随机取出3只(死活均可)，于1 mL PBS中制成匀浆后再进行梯度稀释，分别取各稀释浓度下的10 μL匀浆于固体YPD培养基上，35 ℃培养48 h后对其进行菌落计数。所有实验在相同实验条件下重复3次。进行统计分析时使用GraphPad Prism6.0软件。

2.2.3 大蜡螟病理切片观察 每组选取16只适龄大蜡螟幼虫，实验步骤同“2.2”项下。培养48 h后，分别从各实验组中随机取出1只幼虫(死活均可)进行PAS糖原染色。所有实验在相同实验条件下重复3次。

3 实验结果

3.1 体外作用结果 由表1可以看出，以FICI模型评价药物作用时，两个药物联用对两株耐药白色念珠菌均有协同作用，而对两株敏感白色念珠菌表现为无关作用；以△E模型评价时，两个药物联用对两株耐药白色念珠菌也有协同作用，但对两株敏感白色念珠菌表现为拮抗。上述两个评价方法共同说明两个药物联用对耐药白色念珠菌有明显的协同对抗作用，但是对敏感白色念珠菌无协同作用。

表1 以FICI模型和△E模型评价药物体外抗白色念珠菌作用

注：MIC：最低抑菌浓度；MICA：伏立康唑单用的最低抑菌浓度；CA：药物联用时伏立康唑的最低抑菌浓度；MICB：布地奈德单用的最低抑菌浓度；CB：药物联用时布地奈德的最低抑菌浓度；FICI：分数抑菌浓度指数；ΣSYN：96孔板中所有正值△E之和；ΣANT：96孔板中所有负值ΔE之和。IN：interpretation，解释；NI：no interaction，无关作用；SYN：synergism，协同作用；ANT：antagonism，拮抗作用

3.2 体内作用结果

3.2.1 药物单用或联用对感染大蜡螟的生存率影响 由图1A可以看出，对于感染CA4的大蜡螟，各组的生存率均无显著性差异(P>0.05)，说明两药联用对感染敏感白色念珠菌的大蜡螟生存率无显著影响；图1B可以看出，对于感染CA10的大蜡螟，与对照组相比，药物单用对感染的大蜡螟生存率均无显著的影响(P>0.05)，但两药联用组的生存率显著提高(P<0.05)，说明两药联用可显著提高感染耐药白色念珠菌的大蜡螟生存率。

A.感染CA4的大蜡螟；B.感染CA10的大蜡螟；VRC.伏立康唑；BUD.布地奈德图1 药物单用或联用对感染后的大蜡螟生存率的影响

3.2.2 药物单用或联用对感染大蜡螟的载菌量的影响 由图2A可以看出，对于感染CA4的大蜡螟，各组的载菌量均无显著性差异(P>0.05)，说明两药联用对感染敏感白色念珠菌的大蜡螟体内载菌量无显著影响；图2B可以看出，对于感染CA10的大蜡螟，与对照组相比，药物单用对感染耐药白色念珠菌的大蜡螟的体内载菌量均无显著的影响(P>0.05)，但两药联用组的载菌量显著降低(P<0.05)，说明两药联用可显著降低感染耐药白色念珠菌的大蜡螟体内载菌量。

3.2.3 药物单用或联用对感染大蜡螟的组织的影响 组织病理学切片中的黑色团块是白色念珠菌细胞及菌丝形成的团块。通过观察图3的大蜡螟感染后的病理切片，我们发现：对于感染CA4的大蜡螟，各组的组织病理学切片中黑色团块数量及组织破坏情况均无显著性差异，说明两药联用对感染敏感白色念珠菌的大蜡螟的组织病理学无显著影响；图3B可以看出，对于感染CA10的大蜡螟，与对照组相比，药物单用对感染耐药白色念珠菌的大蜡螟的黑色团块数量及组织破坏情况无显著性差异，但两药联用组的黑色团块数量明显减少、组织破坏程度差，说明两药联用可显著降低感染耐药白色念珠菌的大蜡螟的体内真菌数量，从而降低对大蜡螟的组织损伤。

A.感染CA4的大蜡螟；B.感染CA10的大蜡螟；VRC.伏立康唑；BUD.布地奈德图2 药物单用或联用对感染后的大蜡螟体内载菌量的影响

A.感染CA4的大蜡螟；B.感染CA10的大蜡螟。图中a～c：对照组；d～f：伏立康唑；g～i：布地奈德；j～l：伏立康唑+布地奈德；VRC.伏立康唑；BUD.布地奈德。图中“—”代表200 μm图3 药物单用或联用对感染后的大蜡螟组织的影响

4 讨论

近年来，白色念珠菌对现有为数不多的抗真菌药物表现出耐药性，该问题已成为困扰公众健康和临床医护人员的一大难题[1-2]。目前临床可用的抗真菌药物品种有限，且大多价格昂贵、毒副作用明显，使得非抗真菌药物与抗真菌药物的联合应用成为近年来的研究重点[3,7-10]。三唑类抗真菌药物作为经典的抗真菌药物，临床应用非常广泛，伏立康唑作为新一代三唑类抗真菌药，具有生物利用度高、组织分布广、透过深部组织能力强等特点，备受关注。

在临床抗感染治疗过程中，一般感染不用糖皮质激素，因为目前认为糖皮质激素本身无抗真菌作用，且具有免疫抑制作用，担心应用后会引起感染扩散或诱发二重感染。但在临床上布地奈德与抗真菌药物有联合应用的机会：在重症感染时，为了减轻感染造成的炎症反应，通常在抗菌药物“保驾护航”下使用糖皮质激素，并且临床上也的确获得了满意的效果。

本研究体外结果显示，伏立康唑与布地奈德联用时，对敏感白色念珠菌表现为无关或拮抗作用，但对耐药白色念珠菌有明显的协同作用，提示我们找到了一种能够在体外增加耐药白色念珠菌对伏立康唑敏感性的药物-布地奈德。这对克服现有的白色念珠菌耐药问题有着重大意义。此外，为进一步探究伏立康唑与布地奈德联用对白色念珠菌的体内作用效果，本实验采用一种新型生物侵染模型-大蜡螟，通过测定感染后大蜡螟的生存率、载菌量以及病理学组织学变化3个指标对药物联用的体内作用进行详细评价。体内研究结果表明：伏立康唑和布地奈德联用时，对感染敏感白色念珠菌的大蜡螟无显著体内疗效，但对感染耐药白色念珠菌的大蜡螟体内疗效显著，不仅能明显提高其生存率、减慢虫体内真菌的繁殖速度，还可以明显降低真菌在组织中形成的团块、减少感染对组织的损伤。由此可见，该实验从生存分析、载菌量、组织学研究3个方面明确证明了氟伏立康唑和布地奈德联用对感染耐药白色念珠菌的大蜡螟体内作用疗效，奠定了今后对该药物组合进行哺乳动物药效研究的基础。