咽喉清口含片HPLC特征图谱质量控制方法研究

李文周，李一圣，陈艳艳，胡文会，肖增丽，范晓梅，邱书奇

(1.深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院，广东 深圳 518116；2.深圳市耳鼻咽喉研究所，广东 深圳 518116； 3.暨南大学附属深圳市宝安区妇幼保健院，广东 深圳 518133)

咽喉清口含片是由金银花、玄参、青果和胖大海等十多味药材组成的中药制剂，具有清热解毒、化痰利咽的功能，临床上用于外感风热型急性咽炎的治疗，疗效确切[1]。目前，该制剂主要通过薄层鉴别及绿原酸含量测定来控制产品质量。然而，咽喉清口含片组方药味较多，制备工艺过程中各药味采用分组处理方式，药效物质基础复杂，仅以单一成分的含量为指标进行质量控制存在明显不足，未能全面有效的控制该制剂的综合质量，已不能满足日益严格的药品质量控制要求。因此，我们开展咽喉清口含片的色谱特征图谱研究，并拟将其应用至该制剂的质量标准中，以期更好的对其质量均一性和稳定性进行控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 2695/2998高效液相色谱仪，Empower 3色谱工作站，国家药典委员会中药色谱特征图谱相似度评价系统(2012版)，KQ3200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；分析天平(Sartorius BT 25s、Sartorius BSA124s)。

绿原酸对照品(批号：110753-201314)、次野鸢尾黄素对照品(批号：111557-200602)均购于中国食品药品检定研究院，甲醇、乙腈为色谱级。咽喉清口含片10批为深圳市龙岗区耳鼻咽喉医院院内制剂，由广东五虎山药业有限公司生产，样品批次见表1。

表1 10批咽喉清口含片样品列表

2 方法与结果

2.1 色谱条件 固定相为Waters Symmetry C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液，梯度洗脱，0～5 min：乙腈13%，5～28 min:乙腈13%～57%，28～28.01 min：乙腈57%～13%，28.01～35 min:乙腈13%；检测波长为260 nm；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液制备 取咽喉清口含片，除去包衣，研细，精密称取1.5 g，加入甲醇30 mL，超声提取30 min(250 W，50 kHz)，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL完全转移至分液漏斗中，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次20 mL，取乙酸乙酯层，合并，蒸干，加甲醇5 mL使溶解并稀释至刻度，滤过，取续滤液，作为供试品溶液[2]。

2.2.2 对照品溶液制备 取绿原酸和次野鸢尾黄素适量，分别加甲醇制成每1 mL含绿原酸30 μg、含次野鸢尾黄素10 μg的对照品溶液[3]，滤过，取续滤液，即得。

2.3 测定法 精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，记录35 min色谱图。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度考察 取同一份供试品溶液(批号：1605101)，连续进样6次，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.26%，各色谱峰的相对峰面积的RSD均小于2.78%，表明仪器精密度符合特征图谱技术要求。

2.4.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号：1605101)，分别于0、2、4、8、12、24 h时进行测定，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.35%，各色谱峰的相对峰面积的RSD均小于3.58%，表明供试品溶液在24 h内保持稳定，符合特征图谱技术要求。

2.4.3 重复性试验 取咽喉清口含片(批号：1605101)，按“2.2.1”项下所述方法制备成供试品溶液6份，按“2.3” 项下所述方法进行测定，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果各色谱峰的相对保留时间的RSD均小于0.31%，各色谱峰的相对峰面积均小于4.72%，表明该方法具有良好的重现性，符合特征图谱技术要求。

2.5 特征图谱共有模式建立[4]取咽喉清口含片10批(见表1),分别制备供试品溶液，按上述“2.1”项下色谱条件进行高效液相色谱(HPLC)分析，记录色谱图，并导入国家药典委员会颁布的“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，经过多点矫正和数据匹配生成色谱特征图谱共有模式，通过比对，确定20个共有特征峰，以对照品进行指认，确定其中5号峰为绿原酸，20号峰为次野鸢尾黄素。以绿原酸色谱峰为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间(各共有峰保留时间与绿原酸峰保留时间之比)及各批次样品图谱与标准图谱的相似度(由相似度评价系统计算导出)。结果10批咽喉清口含片的HPLC色谱图如图1所示，其中R为共有模式标准图谱。各特征峰的相对保留时间见表2，相似度计算结果见表3所示。

结果显示，10批咽喉清口含片样品图谱与标准图谱(见图2)对比，其相似度均不低于0.97，表明该方法稳定可靠，可应用于该制剂的质量控制。根据试验结果，所有被测试的供试品图谱，均应有20个特征峰，且各特征峰的相对保留时间应如表2所示。

图1 10批咽喉清口含片的HPLC色谱图及其共有模式图谱

图2 咽喉清口含片HPLC标准特征图谱及共有峰

表2 咽喉清口含片特征图谱中各共有特征峰的相对保留时间表

表3 10批样品图谱与标准图谱相似度

3 讨论

3.1 相对于化学药品成分组成的清晰明了，中药复方制剂成分复杂难明，以单一成分为指标对中药制剂进行质量控制的方法，常在科学性和合理性方面受到质疑，为此业界也在不断探索更加合理的质量控制方法，其中，色谱特征图谱质控技术作为一种能更好体现中药成分整体性的技术手段，近年来在中药制剂质量标准中的应用越见广泛[5]。咽喉清口含片处方由十多味中药组成，在制备时，考虑到各药味的不同性质，采用了分组处理工艺，金银花、玄参和青果等采用水提工艺，而射干、山豆根和锦灯笼等采用醇提工艺。分组处理工艺兼顾了组方药味各自所含有效成分的特点，同时也对其质量控制方法提出了更高的要求，尤其是在制剂制备过程的控制上，如何有效控制不同处理组中间产物的质量，是我们必须重点考虑的问题。

咽喉清口含片此前的质量标准主要依赖多味药材的薄层鉴别和绿原酸的含量测定，这显然无法满足我们对该制剂的质量控制要求。该标准中，绿原酸为处方中君药金银花的主要有效成分，其含量测定结果可一定程度上反映水提组工艺和质量情况，但醇提组的相关情况则为监控盲点，那么是否再建立一个指标成分的含量测定方法？或者还有更合理的解决方案？基于此考虑，我们建立咽喉清口含片色谱特征图谱质控方法，并将其增补至制剂和中间品的内控标准中，应用于制剂制备的全过程控制，以期更好的保证所生产制剂质量的一致性和均一性。初步试验结果表明，该方法合理可行，其有效应用，可获得良好效果。

3.2 必须指出，本试验仅使用连续生产的10批产品进行研究测试，样本量较少，考察仍然不够充分。限于客观条件，咽喉清口含片虽已获得国家中药六类新药临床批件，并完成临床试验，但现阶段仍然仅为医疗机构制剂，生产批次不多，随着后续生产批次的不断增多，所建立的图谱仍需不断进行验证完善。

3.3 本试验初步以绿原酸和次野鸢尾黄素对照品进行色谱峰的指认，其中绿原酸为处方中君药金银花的主要有效成分，次野鸢尾黄素则为射干中主要有效成分之一[6]。两种成分可分别在一定程度上反映水提组药味和醇提组药味的工艺和质量情况，初步验证所建立的特征图谱质控方法。后续的试验中，考虑进一步进行多色谱峰归属指认，再分别于细胞水平和动物水平上，开展基于抗炎抗氧化作用的谱效关系探讨[7-9]，以揭示咽喉清口含片的组方合理性和组分作用机制。

3.4 由于成分的复杂性，多数中药制剂的HPLC特征图谱洗脱时间较长，考虑到药品生产过程中时间成本和有机试剂耗用量的节约，建立方法时，我们在保证色谱峰分离情况的基础上，尽量缩短样品进样洗脱时间，控制整个过程的时长，以提高效率。当然，随着色谱技术的进步，控制时长提高效率的方法已经有了更多选择，如利用超高效液相色谱(UPLC)来进行分析等，但由于咽喉清口含片生产单位的条件限制，现阶段乃至未来一段时期内，HPLC法仍然不可替代，因此我们只能尽量控制其洗脱时长。

3.5 试验过程中，我们曾以绿原酸和次野鸢尾黄素综合转移率为指标，对供试品溶液制备方法进行考察，比较了甲醇提取后乙酸乙酯萃取和乙酸乙酯直接提取的效果，结果乙酸乙酯直接提取所制备的供试品溶液，色谱信息不够丰富，部分色谱峰极小，不利于积分统计，因此确定先以甲醇提取后加乙酸乙酯进行萃取。在此基础上又考察了提取溶剂(水、甲醇)、提取方式(超声提取、加热回流提取)、提取时间、萃取次数、萃取溶剂用量等条件，结果确定供试品溶液制备方法如正文所示。