黑螵蛸多糖的制备及活性测定

梅桂雪，孙 捷，王晓静*

（1.济南大学 山东省医学科学院 医学与生命科学学院，山东 济南 250200；2.山东省医学科学院 药物研究所，山东 济南 250062；3.国家卫生部生物技术药物重点实验室 山东省罕少见病重点实验室，山东 济南 250062）

黑螵蛸是螳螂科昆虫巨斧螳螂（Hierodula patelliferServille）的干燥卵鞘，与团螵蛸、长螵蛸统称为桑螵蛸，是我国传统的昆虫类中药材之一[1]。桑螵蛸入药性平，味苷、咸，有补肾、助阳、固精、缩尿等功能，主治肾阳不足、遗精、阳萎、早泄、白浊、赤白带下、小便频数、遗尿等症[2]。桑螵蛸多与其他中药配伍，用于治疗小儿遗尿等症[3]。桑螵蛸其化学成分主要有蛋白质、氨基酸、糖类、脂类等[4]。目前桑螵蛸的研究主要集中在团螵蛸，从团螵蛸植物源成分中分离得到二萜、黄酮等化合物[5]；桑螵蛸具有较强的抗氧化活性和抗动脉粥样硬化活性，粗提物对四氧嘧啶糖尿病小鼠有良好的治疗作用[6]，挥发油提取物对金黄色葡萄球菌有一定的体外抑菌效应[7]。就目前情况来看，对于黑螵蛸的研究较少，且未见黑螵蛸多糖提取分离、抗氧化、抗菌和抑制胆碱酯酶活性的研究报道。

多糖广泛存在于微生物、动植物中，由于其各种生物学功能而受到营养和生化科学家的关注[8]。另外，已被报道的多糖大多无毒、副作用少，可潜在用于食品医药和化妆品行业[9]。多糖的药理活性包括抗氧化、抗菌、抗肿瘤、保肝、免疫调节和抗病毒[10-11]。多糖具有生物相容性，被认为是重要的膳食自由基清除剂，主要用于防止氧化损伤[12]。有关多糖的报道中，未见多糖抑制胆碱酯酶的研究。胆碱酯酶是一类糖蛋白，分为乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE），二者共同调节乙酰胆碱的分解，影响神经信号的传递，双重胆碱酯酶抑制剂是目前最普遍认可的阿尔茨海默病（AD）治疗手段。因此寻找AChE和BuChE的双重抑制剂成为AD治疗的新策略[13]。

本实验采用水提-醇沉法制备黑螵蛸粗多糖，经DEAE Sephadex A-25离子交换柱色谱和Sephadex G-75凝胶柱色谱得到均一的黑螵蛸多糖组分。采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羟基自由基清除法测定黑螵蛸多糖的抗氧化能力。采用贴片法测定多糖的抑菌圈，二倍稀释法测定其最小抑菌浓度。采用5,5’-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）法测定多糖AChE和BuChE抑制活性，为黑螵蛸多糖进一步研发成新的抗氧化剂、抑菌剂和胆碱酯酶双重抑制剂提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1.2 ZX-LGJ-1型真空冷冻干燥机（上海知信仪器）； LD25-2型离心机（北京医用离心机厂）；U-3000型紫外可见分光光度计（日本日立）；Rotavapor R-200型旋转蒸发仪（Buchi公司）；Viscotek TDA305max多检测器凝胶渗透色谱仪（英国Malvern公司）；中低压制备型液相色谱仪（博纳艾杰尔公司）；XS105型分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；THZ-103B 恒温培养摇床（上海一恒）； BMJ-160型培养箱（苏州赛恩斯）；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械）。

1.2 材料

黑螵蛸购自安国市启航中药材销售有限公司，经南京中医药大学刘训红教授鉴定，样本为巨斧螳螂（Hierodula patelliferServille）的干燥卵鞘黑螵蛸。大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌由山东省食品药品检验研究院提供。

DPPH（美国Sigma公司）；维生素C（国药集团）；碘化乙酰硫代胆碱，碘化丁酰硫代胆碱，十二烷基硫酸钠，乙酰胆碱酯酶（来源于电鳗鱼），多奈哌齐（上海麦克林）；5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB），丁酰胆碱酯酶（来源于马血清）（上海阿拉丁）；牛肉膏，蛋白胨（北京奥博星公司）；青霉素-链霉素双抗（索莱宝）；DEAE Sephadex A-25，Sephadex G-75（源叶生物）；氯化钠，三氯甲烷，正丁醇，无水乙醇等化学试剂均为分析纯（天津富宇精细化工）。

2 方法

2.1 黑螵蛸粗多糖的提取

采用水提-醇沉淀的方法提取黑螵蛸多糖[14]：将黑螵蛸样品置入60 ℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥处理，用高速多功能粉碎机粉碎，备用，按料液比1:10加入蒸馏水，90 ℃加热煮沸5～10 h，过滤，滤渣反复浸提3次后合并滤液，浓缩至一定体积，加入4倍体积的无水乙醇，搅拌均匀后于4 ℃沉淀过夜。3000 r/min离心15 min，收集沉淀，无水乙醇洗涤沉淀至醇溶液无色，将沉淀置于通风处挥发至无醇味，得黑螵蛸粗多糖，备用。采用Sevag[15]法除蛋白，将粗多糖加适量水溶解，加入等体积的由三氯甲烷:正丁醇（4:1，v/v）混合的Sevag液，于分液漏斗中混合震荡后静置，反复萃取除去蛋白质，上层多糖水溶液冷冻干燥后即得脱蛋白后的粗多糖。

2.2 黑螵蛸多糖的分离纯化

用离子交换色谱（DEAE Sephadex A-25）和凝胶过滤色谱（Sephadex G-75）分离纯化黑螵蛸粗多糖。将冻干的粗多糖粉末溶解于蒸馏水中，用DEAE Sephadex A-25中压制备柱（2.6 cm×46 cm）进行分离纯化，依次用蒸馏水和0.05～1 mol/L氯化钠溶液以1 ml/min的流速连续洗脱，自动部分收集器收集洗脱液（每管3 ml），采用硫酸-苯酚法[16]跟踪监测，以试管号为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制洗脱曲线，依据曲线，合并同一洗脱峰的各管洗脱液，冷冻干燥，得到多糖组分。用Sephadex G-75（2.6 cm×96 cm）中压制备柱进一步纯化多糖，用蒸馏水以1 ml/min的流速洗脱，每管5 ml，绘制洗脱曲线，合并同一洗脱峰的各管洗脱液，将得到的精制多糖组分冷冻干燥。

2.3 黑螵蛸多糖组分的紫外光谱分析

称取多糖精制样品适量，配制成1 mg/ml水溶液，采用紫外分光光度计进行全波长（190～900 nm）扫描，观察图谱是否有吸收峰。

2.4 黑螵蛸多糖相对分子质量（Mr）的测定

采用凝胶渗透色谱测定多糖Mr，示差光检测器监测。仪器：Viscotek TDA305max多检测器凝胶渗透色谱仪；色谱柱：AGuard+1xA6000M；流动相：0.1 mol/L NaNO3+0.02% NaN3；流速：0.7 ml/min；检测器温度：35 ℃；柱温：35 ℃；进样量：100 µl。

2.5 黑螵蛸多糖的抗氧化活性检测

2.5.1 DPPH自由基清除能力的测定[17]精密称取DPPH样品10 mg，用无水乙醇溶解，定容于250 ml棕色量瓶（浓度0.1 mmol/L），0～4 ℃避光保存。试管中加入DPPH溶液2 ml，样品溶液1 ml，室温下避光静置30 min，测定517 nm处吸光度Ai；以蒸馏水1 ml代替样品溶液1 ml测得吸光度A0；以无水乙醇2 ml代替DPPH溶液2 ml测得吸光度Aj；每个样品做3个平行，按以下公式计算清除率。

DPPH自由基清除率（%）=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

以半数抑制率（IC50）表示DPPH自由基清除能力，提取物的IC50值越小，表示其抗氧化能力越强。

2.5.2 羟基自由基清除能力测定[18-19]分别取1 mmo1/L FeS04（用10 mmoL/L H2SO4溶液配置），1 mmo1/L水杨酸（用无水乙醇配置），0.03%H2O21 ml于10 ml试管中，再加入1 ml不同浓度的样品溶液。以1 ml 0.3% H2O2启动反应，3 ℃水浴30 min，以蒸馏水作为空白对照，维生素C作为阳性对照，测定510 nm处反应液的吸光值A1。以1 ml蒸馏水代替样品溶液测得吸光度A0；以1 ml无水乙醇代替水杨酸测得吸光度A2；每个样品做3个平行，按以下公式计算清除率（IC50）。

羟基自由基清除率（%）=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

2.5.3 数据处理 用IBM SPSS Statistics 22.0软件对结果进行方差分析，比较各组实验效果。

2.6 黑螵蛸多糖的抗菌活性测定

称取适量黑螵蛸精制多糖样品，用蒸馏水配制成50 µg/ml的溶液，无菌过滤器过滤除菌，4 ℃冰箱保存备用。将牛肉膏蛋白胨固体培养基（加琼脂）倒入培养皿中，冷却备用。倒取适量牛肉膏蛋白胨液体培养基（不加琼脂）于试管中，接种环沾取菌株于试管中，37 ℃、100 r/min于恒温培养摇床中培养。待培养基变浑浊（有菌生长）后，吸取少许菌悬液于固体培养基上，涂布器均匀涂布，37 ℃培养箱中培养。将浸润黑螵蛸多糖、青霉素和链霉素的滤纸片（每个滤纸片直径6 mm） 贴在已涂布菌种的培养基上，37 ℃培养18～24 h。观察抑菌圈的有无及其大小，即可判断其敏感性，统计抑菌圈直径。抑菌效果判断标准为：D≤8 mm为不敏感，8 mm＜D≤13 mm为低度敏感，13 mm＜D≤19 mm为中度敏感，D＞19 mm为高度敏感），采用二倍稀释法[20]测定有抑菌效果样品的最小抑菌浓度（MIC）。

2.7 黑螵蛸多糖胆碱酯酶抑制活性测定

2.7.1 AChE抑制活性测定 采用改良的Ellman方法[21]测定AChE抑制活性。用PBS（pH 8.0，0.1 mol/L）配制浓度为0.2 U/ml乙酰胆碱酯酶溶液（50 mg酶用水定容到50 ml），0.75 mmol/L DTNB溶液，1.5 mmol/L碘化乙酰硫代胆碱，3%SDS终止液。依次向试管中加入 PBS（pH 8.0，0.1 mol/L）2.65 ml，DTNB 100 μl、不同浓度的样品100 μl、酶溶液50 μl，37 ℃水浴中预热5 min，加入底物100 μl，37 ℃水浴温浴20 min，迅速加入3%SDS 1 ml终止反应，测定412 nm处吸光度A1。以100 μl 甲醇代替样品溶液测得吸光度A0；以100 μl PBS代替底物测得吸光度A2；按下式计算AChE半数抑制率（IC50）。

AChE抑制率（%）=[A0-(A1-A2)]/A0×100%

2.7.2 BuChE抑制活性测定 采用改良的Ellman方法，具体操作步骤与AChE测定方法相同。只是将AChE抑制活性测定中的底物碘化乙酰硫代胆碱替换成碘化丁酰硫代胆碱，其他反应溶液配制和具体操作步骤与AChE抑制活性测定时相同。

3 结果与讨论

3.1 黑螵蛸多糖提取与分离

黑螵蛸多糖经DEAE Sephadex A-25阴离子交换柱分离，硫酸-苯酚法检测，得到2个单一洗脱峰，洗脱曲线见图1。洗脱峰1是水洗脱产物，为中性多糖。洗脱峰2是盐洗脱产物，为酸性多糖。合并峰1、峰2，冷冻干燥，峰2的量不足5 mg不作为重点研究对象。峰1为主要组分，命名为H-1。

图1 黑螵蛸多糖DEAE Sephadex A-25色谱柱洗脱曲线

H-1经Sephadex G-75凝胶分子筛纯化，洗脱曲线见图2。洗脱后得到对称单峰，命名为HPP-1，初步说明获得了Mr均一的多糖组分。

图2 黑螵蛸多糖H-1经DEAE Sephadex G-75色谱柱纯化洗脱曲线

3.2 黑螵蛸多糖紫外光谱分析

黑螵蛸精制多糖HPP-1紫外扫描结果见图3。由图3可见，该多糖在200 nm处有多糖吸收峰。核酸的特征吸收波长为260 nm，蛋白质的特征吸收波长为280 nm，色素的特征吸收波长为620 nm，图3显示该多糖在以上3个波长处均无吸收峰，表明HPP-1不含核酸、蛋白质和色素。

图3 HPP-1的紫外扫描光谱

3.3 黑螵蛸多糖Mr的测定

对精制黑螵蛸多糖进行凝胶渗透色谱分析，示差光检测器检测，经仪器计算得黑螵蛸精制多糖Mr为13 048。

3.4 黑螵蛸多糖的抗氧化活性

黑螵蛸多糖HPP-1的DPPH自由基和羟基自由基清除活性测定结果见表1。由表1可见，HPP-1对DPPH自由基有清除作用，但清除能力稍弱于维生素C。HPP-1对羟基自由基清除能力较强，强于阳性对照维生素C。羟基自由基能与体内的脂类、蛋白质、核酸、多肽等物质发生反应，对体内的生物大分子有很强的氧化破坏效应，对细胞和组织产生氧化损伤，引起组织器官病变，导致机体衰老[22]。黑螵蛸多糖HPP-1羟基自由基清除能力较强，能阻止其与生物体内的生物大分子发生反应，减轻氧化破坏效应引起的细胞与组织损伤。

表1 HPP-1的抗氧化活性

3.5 黑螵蛸多糖的抗菌活性

HPP-1对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抗菌活性测定结果见表2，以稀释200倍的青霉素-链霉素双抗作为阳性对照。由表2可见，HPP-1对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径小于8 mm，属于不敏感，在实验浓度范围内无抑制作用。HPP-1对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径大于19 mm，属于高度敏感，抗菌作用最强。HPP-1对枯草芽孢杆菌的MIC为18.8 μg/ml。

表2 HPP-1的抗菌活性

3.6 黑螵蛸多糖的胆碱酯酶抑制活性

AChE抑制活性测定基本原理是以碘化乙酰硫代胆碱为底物，其在AChE的作用下发生分解反应生成硫代胆碱，与显色剂DTNB迅速反应生成5-巯基-2-硝基苯乙酸，该物质在412 nm处有可见光吸收。若待测提取物对AChE有抑制作用，则反应产物吸收度降低。具体测定结果见表3。由表3可见，HPP-1对AChE和BuChE均有抑制活性。

表3 HPP-1的AChE和BuChE抑制活性

4 结论

采用水提-醇沉方法提取黑螵蛸粗多糖，经DEAE Sephadex A-25离子交换柱色谱和Sephadex G-75凝胶柱色谱分离纯化得到均一的黑螵蛸多糖组分HPP-1，Mr为13 048，且多糖纯度较高，不含核酸、蛋白质和色素。HPP-1对DPPH自由基和羟基自由基均有清除活性，其中羟基自由基清除活性强于阳性对照维生素C，对枯草芽孢杆菌有较强的抑制活性，表明黑螵蛸多糖在天然抗氧化剂、抗菌剂方面有极大的开发潜力。另外实验首次发现HPP-1对AChE和BuChE均有抑制活性。目前批准上市的胆碱酯酶抑制剂都伴随不同程度的毒副作用，多糖类药物来源广泛，具有多种生物学活性，安全无毒副作用，且药物质量通过化学手段容易控制，因此，多糖类药物成为当今功能保健品和绿色食品添加剂研究的一大热点。