HPLC测定不同产地何首乌中二苯乙烯苷和蒽醌类成分的含量

黄晓冰，黄霭霞，王光宁*，金海杰

（1.广东药科大学，广东 广州 510006；2.云浮市厚德中药饮片有限公司，广东 云浮 527300）

何首乌为蓼科植物何首乌的干燥块根，具有解毒、消痈、截疟、润肠通便等功效，用于治疗疮痈，瘰疬，风疹瘙痒，久疟体虛，肠燥便秘[1]。何首乌自然资源分布广泛，主产于广东、四川、贵州、广西等地，其中广东德庆为道地产区，被誉为“何首乌之乡”[2]。何首乌中主要含蒽醌类化合物、二苯乙烯苷等化学成分，蒽醌类成分主要为大黄素、大黄素甲醚等，以游离态和糖苷结合态两种形式存在于植物体内[3]。研究表明二苯乙烯苷具有防治老年痴呆、提高记忆功能、抗衰老、降低胆固醇、提高免疫功能、防治动脉硬化及保护肝脏等作用[4]。蒽醌类成分如大黄素、大黄素甲醚、大黄酸等具有抗肿瘤及提高免疫功能的作用，但也与肝毒性相关[5-6]。研究发现不同产地何首乌中蒽醌类和二苯乙烯苷含量存在一定差异[7]。本实验以二苯乙烯苷、蒽醌等成分为指标，建立何首乌药材的质量评价方法，并比较不同产地何首乌药材的质量优劣。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20AC高效液相色谱仪（日本岛津）；SPDM20A紫外检测器（日本岛津）；Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；AY12电子分析天平（日本岛津）；LD-Y400粉碎机（上海顶帅）；DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山超声仪器公司）。

1.2 材料

贵州产何首乌购于亳州药王谷医药有限公司，广东德庆、广东新兴产何首乌均购自广东银田农业科技有限公司，四川产何首乌购自重庆慧远药业有限公司，以上药材经广东药科大学中药学院中药资源系李书渊教授鉴定均为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorumThunb.的干燥块根。

二苯乙烯苷对照品（含量98.72%，批号：MUST-16121311），大黄素对照品（含量：99.48%，批号：MUST-17102702），大黄素甲醚对照品（含量：99.27%，批号：MUST-17030622），由成都曼斯特生物科技有限公司和中国科学院成都生物研究所共同研制；甲醇，乙腈（色谱纯，购自德国Merck公司）；水为屈臣氏饮用水；甲醇，95%乙醇，无水乙醇，磷酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 二苯乙烯苷的含量测定

2.1.1 对照品溶液的制备 取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡糖苷对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每l ml含0.2 mg对照品的溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约0.2 g，精密称定，置入圆底烧瓶，精密加入稀乙醇25 ml，称定重量，加热回流30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，上清滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相比例：乙腈-水（25:75）；流速：1 ml/min；检测波长：320 nm；柱温：25 ℃。进样量：20 μl。理论塔板数按2,3,5,4’-四羟基二苯乙稀-2-O-β-D-葡糖苷峰计算不低于2000。

2.1.4 专属性 取二苯乙烯苷对照品溶液和样品溶液、空白溶剂，用0.45 μm微孔滤膜过滤后分别进样，记录图谱如下。

图1 二苯乙烯苷测定专属性研究HPLC图谱

由图1可见，二苯乙烯苷对照品溶液与二苯乙烯苷样品溶液的保留时间均为7.5 min左右，空白溶剂无干扰。

2.1.5 线性关系 取二苯乙烯苷对照品溶液，分别精密量取1，2，3，4，6，8 ml，置入10 ml量瓶，稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标拟合回归方程。结果y= 18 660 167x+428 620，r=0.9990，在0.05～0.40 mg/ml范围内线性关系良好。

2.1.6 稳定性试验 取供试品溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，每隔一定时间进样，测定24 h内二苯乙烯苷峰面积变化情况，结果RSD为2.55%，说明样品在24 h内稳定。

2.1.7 精密度实验 取供试品溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，连续进样6次，测定二苯乙烯苷峰面积的变化情况，结果RSD为1.93%，说明仪器精密度良好。

2.1.8 重复性试验 分别取何首乌细粉6份，每份约0.2 g，精密称定后按2.1.2项方法制成供试液，按2.1.3项色谱条件进样，测得峰面积，计算含量。结果二苯乙烯苷的平均含量为2.58%，RSD为2.61%，重现性良好。

2.1.9 加样回收率 取已知含量的何首乌粉末约0.05 g，精密称定，平行6份。另精密称定二苯乙烯苷对照品8 mg，置入10 ml量瓶，用稀乙醇溶解、定容。每份样品加入对照品溶液1.5 ml（相当于二苯乙烯苷1.2 mg），再精密加入11 ml稀乙醇，称重，加热回流30 min，放冷，过滤，取续滤液5 ml，置入10 ml量瓶，稀释至刻度，作为供试品，按2.1.3项色谱条件进样，测得峰面积，计算含量，结果见表1。平均加样回收率为99.17%，RSD为0.92%，表明该方法的回收率符合要求。

表1 二苯乙烯苷的加样回收实验结果（n=6）

2.1.10 检测限与定量限 精密量取二苯乙烯苷标准溶液适量，置入10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为二苯乙烯苷检出限系列溶液。将对照品溶液稀释后进样检测，记录各色谱峰面积，以S/N=3作为检出限检测标准，以S/N=10作为定量限检测标准。结果二苯乙烯苷的定量限为88.62 ng，检出限为26.59 ng。

2.2 蒽醌类成分的HPLC测定

2.2.1 对照品溶液的制备 取大黄素对照品、大黄素甲醚对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，分别制成每1 ml含大黄素80 μg、大黄素甲醚40 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约l g，精密称定，置入圆底烧瓶，精密加入甲醇50 ml，称定重量，加热回流1 h，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液5 ml，作为供试品溶液A（测游离蔥醌用）。另精密量取续滤液25 ml，置入圆底烧瓶，水浴蒸干，精密加8%盐酸溶液20 ml，超声处理（功率100 W，频率40 kHZ）5 min，加二氯甲烷20 ml，水浴中加热回流1 h，取出，立即冷却，置入分液漏斗，用少量二氯甲烷洗涤容器，洗液并入分液漏斗，分取二氯甲烷液，酸液再用二氯甲烷振摇提取3次，每次15 ml，合并二氯甲烷液，回收溶剂至干。残渣用甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液B（测总蒽醌用）。

2.2.3 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相比例：甲醇-0.1%磷酸（85:15）；流速：1 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃。进样量：20 μl。理论塔板数按大黄素峰计算不低于3000。

2.2.4 专属性 取空白溶剂、大黄素对照品溶液、大黄素甲醚对照品溶液和供试品溶液A分别进样，记录图谱，见图2。

2.2.5 线性关系 分别精密量取大黄素对照品溶液0.5，1，2，4，6，8 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按2.2.3项色谱条件进样分析。分别精密量取大黄素甲醚对照品溶液0.75，1.5，3，5，7，9 ml于10 ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀后按2.2.3项色谱条件进样分析。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程，绘制标准曲线。大黄素的回归方程为：y=45 298 211x+4159（r=0.9999），在0.0055～0.1110 mg/ml范围内线性较好。大黄素甲醚的回归方程为y=51 308 574x-530（r=0.9998），在0.003～0.040 mg/ml的范围内线性良好。

图2 蒽醌测定专属性研究HPLC图谱

2.2.6 稳定性试验 取供试品溶液A，按2.2.3项色谱条件进样分析，每隔一定时间进样，记录24 h内大黄素和大黄素甲醚峰面积变化情况，结果RSD为1.37%，1.35%，说明样品稳定性良好。

2.2.7 精密度实验 取供试品溶液A，按2.2.3项色谱条件进样分析，连续进样6次，记录大黄素及大黄素甲醚的峰面积，结果RSD为1.21%，1.24%，说明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验 分别取何首乌细粉 6 份，每份约1 g，按2.2.2项方法制备游离蔥醌供试液，按2.2.3项色谱条件进样分析，记录大黄素和大黄素甲醚的峰面积，计算含量和RSD。结果表明，大黄素平均含量为0.06%，RSD为1.88%，大黄素甲醚平均含量为0.025%，RSD为2.63%，结果表明大黄素和大黄素甲醚的重现性良好。

2.2.9 加样回收率试验 取已知含量的何首乌粉末约0.25 g，平行6份，精密称定。另精密称定大黄素对照品1.5 mg，大黄素甲醚对照品0.5 mg，分别置入10 ml量瓶，用甲醇定容。样品中加入大黄素对照品溶液1 ml （相当于大黄素0.15 mg）和大黄素甲醚对照品溶液1 ml（相当于大黄素甲醚0.05 mg），再精密加入23 ml甲醇，称重，加热回流1 h，放冷，过滤，取续滤液作为供试品，0.45 μm微孔滤膜过滤，进样，记录峰面积，计算回收率，结果见表2、表3。

表2 大黄素的加样回收实验结果（n=6）

表3 大黄素甲醚的加样回收实验结果（n=6）

由表2、表3可见，大黄素、大黄素甲醚的平均回收率分别为95.70%和103.79%，RSD分别为0.47%和0.8%，表明本方法的回收率良好。

2.2.10 检测限与定量限 取大黄素、大黄素甲醚标准溶液适量，置入10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为大黄素、大黄素甲醚检出限系列溶液。将对照品溶液稀释后进样检测，记录各色谱峰面积，以S/N=3作为检出限检测标准，以S/N=10作为定量限检测标准。结果表明，大黄素的检出限为9.74 ng，定量限为32.6 ng。大黄素甲醚的检出限为3.33 ng，定量限为11.1 ng。

2.3 不同产地何首乌中二苯乙烯苷和蒽醌类成分的含量测定

取不同产地样品，按2.1.2项方法制成供试液，按2.1.3项色谱条件进样，测定二苯乙烯苷含量。不同产地样品按2.2.2项方法制成游离蒽醌和总蒽醌供试液，按2.2.3项色谱条件进样分析，测定总蒽醌和游离蒽醌的含量，结合蒽醌含量为总蒽醌与游离蒽醌含量之差。结果二苯乙烯苷含量分别为：四川2.22%，贵州1.83%，德庆2.49%，新兴2.39%，结合蒽醌含量分别为：四川0.39%，贵州0.44%，德庆0.48%，新兴0.57%。

4个产地样品的二苯乙烯苷和结合蒽醌含量均达到药典要求。在这4个产地中德庆产的何首乌中二苯乙烯苷和结合蒽醌含量之和最高，说明德庆产的何首乌质量较高。

3 讨论

蒽醌类成分测定方法学考察中，游离蒽醌是指游离大黄素和游离大黄素甲醚，结合蒽醌是两者与糖结合而成的苷，总蒽醌包含游离态和结合态的大黄素和大黄素甲醚，结合蒽醌含量为总蒽醌与游离蒽醌含量之差。结合蒽醌测定前先水解为游离态再测定含量，因此方法学考察以游离蒽醌为样品。

本文建立的二苯乙烯苷和蒽醌类含量测定方法不仅可用于何首乌药材的质量评价，也可用于含何首乌的复方制剂的质量控制。本文对蒽醌类HPLC测定色谱条件进行了优化，比较了不同比例流动相的分离效果，结果表明流动相为甲醇-0.1%磷酸水（85:15）时大黄素和大黄素甲醚的峰形对称且保留时间稳定，可作为含量测定的流动相。

二苯乙烯苷为一种植物抗毒素，是由植物在紫外线照射、机械损伤、真菌感染等不利条件下产生的。何首乌的道地产地广东德庆、新兴等均位于广东中部偏西，位于北回归线附近，日照充足，紫外线照射丰富，气候湿热，有利于真菌的产生，因此该产地的何首乌中二苯乙烯苷含量较高。而贵州、四川等产地位于北回归线以北，紫外线照射相对于广东地区要少，且天气不如广东地区的湿热，真菌活动受到影响，故二苯乙烯苷含量较广东产区的低。本实验结果表明，广东德庆、新兴产何首乌中二苯乙烯苷及结合蒽醌的含量高于四川、贵州产区，说明不同产区的何首乌中有效成分含量存在一定的差异，广东道地产区的何首乌质量较优。