高效液相色谱法同时测定葛根散中葛根素、大豆苷的含量

石金敏 ，张彩光，周 灿，王 佳，余文锋,余绪明*

（1.十堰市人民医院（湖北医药学院附属人民医院） 药学部，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院 药学院，湖北 十堰 442000）

葛根散是由甘草、干葛花、葛根、缩砂仁、贯众等5种中药材组成，出自《儒门事亲》卷十二，用于治疗饮酒过度，酒毒内蕴者[1-3]。该制剂除贯众外均为药食两用药材，有研究表明，葛根素和大豆苷为其主要活性成分[4]。因此，本实验首次建立了同时测定葛根素和大豆苷2种指标性成分的含量测定方法，可用于葛根散的质量控制，亦为进一步开发保健品提供数据支持。

1 仪器与试药

日本岛津LC-20AT、LC-20A高效液相色谱仪；分析天平（FA2004，上海天平仪器厂）。

葛根素（批号：110752-201615）、大豆苷（批号：111738-201603），均购于中国食品药品检定研究院；葛根散（我院制剂室制备的水煎合剂，批号：20180107，20180108，20180109）。乙腈（色谱纯），水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果[5-9]

2.1 色谱条件

色谱柱Inertsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液（10:90）；流速1.00 ml/min，柱温为35 ℃，进样10 μl，葛根素和大豆苷检测波长250 nm；在此条件下，葛根素和大豆苷色谱峰分离度，峰形等均符合要求。色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图

2.2 对照品溶液的制备

取葛根素、大豆苷对照品适量，精密称定，分别加水制成每1 ml含28，16 μg溶液，即得对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密量取本品1 ml，置入10 ml量瓶，加水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系、定量限考察

取葛根素、大豆苷对照品适量，精密称定，置入10 ml量瓶，加水溶解并添加至刻度，摇匀，用水逐级稀释，分别得葛根素对照品溶液质量浓度为90，45，22.5，11.3，5.6，2.8，1.4 μg/ml，大豆苷对照品溶液质量浓度为160，80，40，20，10，5，2.5 μg/ml。精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），进样浓度（µg/ml）为横坐标（X）绘制标准曲线，计算回归方程分别为葛根素Y=66 104X+2578.4，r=1.0000；大豆苷Y=33 647X+5873.4，r=1.0000；结果表明，葛根素、大豆苷进样浓度分别在1.4～90 μg/ml、2.5～160 μg/ml之间与峰面积线性关系良好。葛根素、大豆苷定量限分别为0.175，0.8 μg/ml。

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液（批号20180107）10 μl，连续进样6次，计算葛根素、大豆苷峰面积RSD值分别为0.51%，0.69%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

取同一样品，按2.3项下方法制备6份供试品溶液（批号20180107），测定峰面积，计算葛根素和大豆苷含量，RSD值分别为0.70%，0.85%，表明该方法重复性较好。

2.7 中间精密度试验

由不同人员分别在不同日期和不同仪器设备，精密量取葛根散样品（批号20180108），按2.3项方法制成供试品溶液，平行6份，按2.1项色谱条件测定，计算含量，结果葛根素和大豆苷RSD值分别为1.54%，1.89%，表明中间精密度良好。

2.8 稳定性实验

精密吸取同一供试品溶液（批号20180107）10 μl，分别于0，2，4，6，8，12，24 h进样10 μl，测定峰面积，计算RSD分别为1.19%，0.94%，表明供试品溶液24 h内稳定。

2.9 加样回收实验

采用加样回收法，精密量取同一样品（批号20180107）6份，加入适量葛根素、大豆苷对照品，依据2.3项制备供试品溶液，按2.1项色谱条件分别进样，得平均加样回收率分别为97.57%，99.64%，RSD分别为1.75%，1.96%。表明方法回收率较好。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.10 样品测定

精密量取3批葛根散样品，按2.3项方法制备供试品溶液，按2.1项条件测定，计算3批制剂中葛根素、大豆苷含量，结果见表2。

表2 葛根散样品测定结果（n=3）

2.11 耐用性试验

2.11.1 检测波长耐用性试验 调整检测波长分别245，250，255 nm，其余按2.1项方法测定，葛根素含量为0.447，0.449，0.390 mg/ml，大豆苷含量为0.0910，0.0924，0.0891 mg/ml。

2.11.2 流动相pH耐用性试验 调整流动相pH为1.93，2.13，2.33，其余按2.1项方法测定，葛根素含量为0.452，0.449，0.448 mg/ml，大豆苷含量为0.0927，0.0924，0.0931 mg/ml。

2.11.3 流动相比例耐用性试验 调整流动相比例9:91，10:90，11:89，其余按2.1项方法测定，葛根素含量为0.448，0.449，0.449 mg/ml，大豆苷含量为0.0924，0.0924，0.0926 mg/ml。

2.11.4 流速耐用性试验 调整流速0.80，1.00，1.20 ml/min，其余按2.1项方法测定，葛根素含量为0.561，0.449，0.375 mg/ml，大豆苷含量为0.1153，0.0924，0.0772 mg/ml。

2.11.5 柱温耐用性试验 调整柱温30，35，40 ℃，其余按2.1项方法测定，葛根素含量为0.452，0.449，0.448 mg/ml，大豆苷含量为0.0930，0.0924，0.0927 mg/ml。

3 讨论

3.1 流动相的选择

最初尝试甲醇-水（25:75）[10]，发现峰形不好，拖尾严重，故尝试乙腈-0.1%磷酸水11:89、12:88和10:90，发现流动相为乙腈-0.1%磷酸水（10:90）时分离度，峰形等较好，故选择其作为流动相。

3.2 检测波长

对待测成分进行紫外扫描，葛根素、大豆苷的最大吸收波长均为250 nm，故 HPLC 法测定采用250 nm作为检测波长。

2018年6月1日新的国家食品药品监督管局发布2018年27号公告《古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定》，标志着古代经典名方的注册审批终于落地，有利于古代经典名方制剂繁荣发展。本文首次建立HPLC法测定出自于《儒门事亲》的葛根散中葛根素、大豆苷的含量，为其注册审批提供理论支持，进一步为葛根散或治疗酒毒保健品的质量控制提供参考。