珐菲亚协同戊巴比妥钠改善睡眠作用的研究

赵 颖，彭纪铭，路 娟，柴瑞平，吕欣锴，陈 曦*

（1.中国医学科学院·北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.山东中医药大学，山东 济南 250355）

睡眠与觉醒是机体外在表现的两种不同状态，二者昼夜交替往复，保证机体在各种脑力和体力活动过后得以充分休息及恢复，从而更好地适应环境变化[1]。睡眠有多种生理功能，如：对学习记忆的相关信息在大脑皮层进行重组与处理，深化记忆力；对于机体受损细胞有一定修复功能；保证免疫及代谢系统能有条不紊地运行[2]。现今社会人们承受来自不同方面的压力越来越多，睡眠剥夺已经普遍地影响到人们的身体健康及生活习惯，临床分析发现经常患有睡眠剥夺易引发抑郁症及精神分裂等其他相关精神疾病[3]。

珐菲亚，为苋科Amaranthaceae植物巴西人参Pfaffia glomerata的根，在当地民间应用史已有300多年，其药理作用有抗肿瘤、抗炎、壮阳、镇静、保护胃黏膜、抗疲劳和增强免疫力等[4-8]。目前关于珐菲亚改善睡眠作用的研究较少，Fenner等[9]研究证实珐菲亚有改善睡眠的作用，其他并未见相关文献报道。通过预实验，作者发现珐菲亚改善睡眠作用的有效部位与Fenner报道并不吻合。本研究考察了腹腔注射阈剂量和阈下剂量戊巴比妥钠的协同睡眠实验，通过观察统计小鼠睡眠潜伏期、睡眠时间和睡眠发生率确定珐菲亚改善睡眠的作用及其量效及时效关系，并通过检测小鼠皮质、海马和下丘脑中多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）、谷氨酸（Glu）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（NOS）的含量研究珐菲亚改善睡眠的作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

YP10002电子天平（上海越平）；AB265-S电子天平（梅特勒-托利多）；TH101温湿度计（欧达时科技）；98-1-B型电子调温电热套（天津泰斯特）；LD-T100粉碎机（上海顶帅）；eppendorf移液枪（艾本德）；2-16R低温离心机（上海托莫斯）；MX-F涡旋混匀器（北京大龙）；全波长多功能酶标仪（瑞士TECAN）；DK-98-1型电热恒温水浴锅（天津泰斯特）；

1.2 药品与试剂

珐菲亚为苋科Amaranthaceae植物巴西人参Pfaffia glomerata的根，由浙江珐菲亚生物科技有限公司提供；地西泮（北京益民药业，批号H11020898）；羧甲基纤维素钠（天津光复精细化工研究所，批号20150529）；戊巴比妥钠（成都华夏，批号922L0314）；多巴胺ELISA检测试剂盒（南京建成，批号20161215）；谷氨酸ELISA检测试剂盒（南京建成，批号20161216）；一氧化氮ELISA检测试剂盒（南京建成，批号20161209）；5-羟色胺ELISA检测试剂盒（南京建成，批号20161215）；去甲肾上腺素ELISA检测试剂盒（南京建成，批号20161215）；一氧化氮合酶 ELISA检测试剂盒（南京建成，批号20161206）；

1.3 实验动物

ICR品系小鼠，体重18～20g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2016-0002。动物饲养于SPF级动物房（温度23±2 ℃，湿度45%±15%，12:12h明暗交替，动物自主进食进水），实验单位使用许可证编号：SYXK（京）2017-0020。

2 方法

2.1 珐菲亚水提物溶液的制备

准确称取一定量法菲亚药材，置于圆底烧瓶中，加16倍量蒸馏水回流提取1 h，二次加10倍量蒸馏水回流提取1 h，合并滤液，100 ℃水浴蒸发浓缩，然后60 ℃真空干燥。取干燥的珐菲亚水提物加0.5% CMC-Na溶液分别配制成含0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g生药/ml珐菲亚水提物溶液，待用。

2.2 珐菲亚水提物对阈剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠潜伏期、睡眠时间的影响及阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠发生率的影响

将60只小鼠随机分为6组，每组10只。阈剂量组与阈下剂量组均经灌胃给予珐菲亚水提物6 g生药/kg体重，两组空白对照组给予0.5%CMC-Na，两组阳性对照组给予地西泮15 mg/kg，给药体积均为0.02 ml/g。连续给药14 d，末次给药1 h后，阈剂量组腹腔注射戊巴比妥钠44 mg/kg，阈下剂量组腹腔注射戊巴比妥钠29 mg/kg，注射体积0.01ml/g，分别记录阈剂量组、阈剂量空白对照组及阈剂量阳性对照组睡眠潜伏期与睡眠持续时间，以及阈下剂量组、阈下剂量阳性对照组睡眠发生率。

2.3 珐菲亚水提物改善睡眠作用的量效关系研究

将72只小鼠随机分成6组，每组12只。除空白组外各组分别经灌胃给予不同浓度的珐菲亚水提物溶液，即2，4，8，12，16 g生药/kg体重，空白对照组给予0.5%CMC-Na，注射体积均为0.02 ml/g。连续给药14 d，于末次给药1 h后，腹腔注射戊巴比妥钠44 mg/kg，注射体积0.01 ml/g，分别记录各组睡眠潜伏期与睡眠持续时间。

2.4 珐菲亚水提物改善睡眠作用的时效关系研究

将72只小鼠随机分成6组，每组12只。除空白对照组外各组均经灌胃给予珐菲亚水提物溶液16 g生药/kg体重，连续给药时间分别为1，5，10，14，21 d，空白对照组给予0.5%CMC-Na，给药体积均为0.02 ml/g。末次给药1 h后，腹腔注射戊巴比妥钠44 mg/kg，注射体积0.01ml/g，分别记录各组睡眠潜伏期与睡眠持续时间。

2.5 珐菲亚水提物对小鼠脑内DA、NE、5-HT、GLU、NO、NOS含量的影响

将24只小鼠随机分为2组，分别为空白对照组和给药组，每组12只。给药组灌胃给予珐菲亚水提物溶液16 g生药/kg体重，空白对照组给予0.5%CMCNa，给药体积为0.02 ml/g，连续给药14 d，末次给药1 h后，断头处死，冰浴上剥离全脑，快速分离皮质、下丘脑、海马称重。用冷的生理盐水研磨，14 000 r/min离心10 min，取上清，按照试剂盒说明测定DA、NE、GLU、NO、NOS、5-HT含量。

2.6 统计分析

3 结果

3.1 珐菲亚水提物对阈剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠潜伏期、睡眠时间的影响及阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠发生率的影响

结果表明，阳性对照地西泮组能极显著缩短小鼠睡眠入睡潜伏期，并能延长小鼠睡眠时间，显著提高小鼠的睡眠发生率，三者与空白组比较有极显著性差异（P＜0.01），表明该实验方法可靠。给予珐菲亚水提物的阈剂量组能显著延长小鼠睡眠时间，并缩短睡眠入睡潜伏时间，二者与空白组比较有显著性差异（P＜0.05），见表1。给予珐菲亚水提物的阈下剂量组能显著提高小鼠的睡眠发生率，与空白组比较有显著性差异（P＜0.05），见表2。结果表明珐菲亚水提物具有协同戊巴比妥钠改善睡眠的作用。

表1 珐菲亚水提物对阈剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠潜伏期、睡眠时间的影响（，n=10）

表1 珐菲亚水提物对阈剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠潜伏期、睡眠时间的影响（，n=10）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白对照组

睡眠时间/min珐菲亚水提物组65.12±3.64*38.20±22.06*空白对照组-8.78±1.7220.46±22.67阳性对照组-3.35±0.74**64.65±11.96**组别剂量/g·kg-1睡眠潜伏期/min

表2 珐菲亚水提物对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠发生率的影响（，n=10）

表2 珐菲亚水提物对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠发生率的影响（，n=10）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白对照组

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3.2 珐菲亚水提物改善睡眠作用的量效关系研究

与空白对照组比较，16，14 g/kg剂量组小鼠睡眠潜伏期显著缩短，睡眠时间明显延长（P＜0.01或P＜0.05）；而8 g/kg剂量组小鼠仅睡眠时间延长（P＜0.05）；4，2 g/kg对睡眠潜伏期和睡眠时间无明显作用。16 g/kg剂量组小鼠的睡眠潜伏期最短，睡眠时间最长，效果最好。见表3。

表3 珐菲亚水提物改善睡眠作用的量效关系（，n=12）

表3 珐菲亚水提物改善睡眠作用的量效关系（，n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白对照组

睡眠时间/min珐菲亚水提物组25.35±0.6934.09±15.69 44.96±1.3538.24±9.64 84.42±1.1042.56±9.40*124.05±0.76*48.09±8.62*163.70±1.10*56.23±9.62**空白对照组-5.50±1.8332.79±10.14组别剂量/g·kg-1睡眠潜伏期/min

3.3 珐菲亚水提物改善睡眠作用的时效关系研究

结果表明，珐菲亚水提物16 g/kg经灌胃连续给药10 d后开始起效，对小鼠睡眠持续时间有显著延长作用，并能缩短入睡的潜伏时间，二者与空白组比较均有显著性差异（P＜0.05）；随着给药时间延长，睡眠潜伏期显著缩短，睡眠时间显著延长。见表4。

表4 珐菲亚水提物改善睡眠作用的时效关系（，n=12）

表4 珐菲亚水提物改善睡眠作用的时效关系（，n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白对照组

组别时间/d睡眠潜伏期/min睡眠时间/min珐菲亚水提物15.71±1.6430.25±10.42 55.25±0.7936.56±11.86 104.62±0.37*42.75±13.91*143.91±0.74*51.51±10.27**213.85±0.84*52.36±9.65**空白对照-5.87±1.5228.59±10.42

3.4 珐菲亚水提物对小鼠脑内DA、NE、5-HT、Glu、NO、NOS含量的影响。

与空白对照组比较，给予珐菲亚水提物能导致小鼠脑内DA、NE、GLU、5-HT含量明显减少，NO、NOS含量明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表5～表7。

表5 给药后小鼠脑内海马中神经递质及NOS含量的变化（，n=12）

表5 给药后小鼠脑内海马中神经递质及NOS含量的变化（，n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白对照组

组别DA/ng·ml-1NE/ng·ml-15-HT/ng·ml-1Glu/μmol·L-1NO/μmol·L-1NOS/U·mg-1空白组150.23±46.85720.45±63.93295.76±21.10298.03±32.2250.86±22.580.165±0.0024珐菲亚组112.59±47.51600.97±34.00*243.11±15.33**324.41±44.80107.10±31.62*0.171±0.0035

表6 给药后小鼠脑内皮质中神经递质及NOS含量的变化（，n=12）

表6 给药后小鼠脑内皮质中神经递质及NOS含量的变化（，n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白对照组

组别DA/ng·ml-1NE/ng·ml-15-HT/ng·ml-1Glu/μmol·L-1NO/μmol·L-1NOS/U·mg-1空白组144.00±94.62562.87±48.95290.24±29.77373.62±32.4054.71±19.340.157±0.0026珐菲亚组90.01±24.75*499.63±45.12274.58±15.1277.66±23.15**53.43±29.660.167±0.0031*

表7 给药后小鼠脑内下丘脑中神经递质及NOS含量的变化（，n=12）

表7 给药后小鼠脑内下丘脑中神经递质及NOS含量的变化（，n=12）

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空白对照组

组别DA/ng·ml-1NE/ng·ml-15-HT/ng·ml-1Glu/μmol·L-1NO/ng·ml-1NOS/U·mg-1空白组181.83±75.47707.67±37.07279.86±20.90329.78±38.78308.80±50.080.169±0.0046珐菲亚组166.68±12.30749.80±75.00289.56±17.83250.71±54.28*322.67±35.160.165±0.0067

4 讨论

目前，催眠药的药理实验主要是通过观察测试药物对巴比妥类药物或其他催眠药物诱导的睡眠时间等指标的影响，观察测试药物是否能协同戊巴比妥钠的作用，使小鼠入睡数目增加，缩短睡眠潜伏期，延长睡眠时间。以上3项结果中两项呈阳性者，即可判定测试药物具有改善睡眠功能[10-11]。但戊巴比妥钠经过肝药酶代谢，若对肝药酶有抑制的药物，也能延长戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间和缩短其睡眠潜伏期，故能延长戊巴比妥钠睡眠时间者，还必须看到使接受阈下催眠剂量戊巴比妥钠的动物进入睡眠，或能使戊巴比妥钠睡眠醒来的动物重新入睡，以避免单纯抑制肝药酶减少戊巴比妥钠代谢的药物明显影响实验结果[10]。本研究结果表明，珐菲亚水提物能缩短阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠潜伏期并延长其睡眠时长，同时提高阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠发生率，结果表明，珐菲亚水提物具有改善睡眠的功能。

近年研究表明，睡眠是中枢神经系统内一种主动的神经调节过程，与中枢神经系统内某些特定结构及中枢神经递质的作用关系密切[12]。在促睡眠的物质基础研究中发现，睡眠与 DA、NE 和 5-HT 等在内的诸多神经递质关系密切[13]。DA是促觉醒类的神经递质，多巴胺能神经元在睡眠-觉醒中起到重要的调节作用[14]。文献报道，安神中药治疗失眠及睡眠障碍的机制之一是通过加速5-HT的代谢或提高5-羟色胺受体的含量等[15]；大鼠下丘脑视前区5-HT含量增加可引起中枢性疲劳，并促进睡眠，而NE主要以兴奋中枢和觉醒功能为主，两者之间存在相互抑制作用[16-17]。内源性NO是中枢神经系统内一种重要的神经递质，与睡眠-觉醒周期的调控有关[18]。所以本研究选择DA、NE、5-HT、NO等作为珐菲亚改善睡眠作用的细胞因子水平研究。

课题组前期研究显示，珐菲亚改善睡眠作用的有效部位为水提部位。本实验在前期研究基础上对珐菲亚水提物改善睡眠作用的量效、时效关系进行了研究，结果表明，珐菲亚水提物改善睡眠作用的最佳给药量为16 g生药/kg体重，最佳给药时间为14 d。珐菲亚改善睡眠作用的机制为减少DA、NE、GLU等中枢性神经递质在脑中的分泌、释放，促进NOS合成、分泌，提高NO在脑内的含量，并抑制5-羟色胺能神经元，降低5-HT的分泌实现改善睡眠的作用。