橄榄苦苷对核桃油抗氧化稳定性的研究

田 雨 包媛媛 林 奇 杨 明 高聪聪 杜 鹏

(云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201)

核桃油中不饱和脂肪酸含量较高，在人体健康的血压调节、糖尿病预防等方面都有良好保健作用[1-3]，然而在加工、储藏、销售时易存在油脂变质情况，不仅破坏了其内部的营养成分，还危害了身体健康，因此将添加抗氧化剂加入油脂以延缓氧化，延长货架期是一种最为有效的手段。目前我国常用的抗氧化剂丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)等都是化学合成的，存在一定的毒性和副作用，已被一些国家限制或禁止使用[4-5]。对天然抗氧化剂的应用研究以取代化学合成抗氧化剂已成趋势。橄榄苦苷是一种裂环烯醚萜类多酚化合物，有抗菌[6-7]、抗氧化[8-9]、降血压[10-11]、抗肿瘤抗病毒[12-14]等功效，且主要存在于橄榄叶中。人们长期以来更关注研究橄榄果和橄榄油的食品实用性，而其叶却因大量修剪而废弃，未得到合理利用而造成资源浪费。目前，已有较多有关橄榄苦苷的抗氧化活性研究报道，但鲜见将橄榄苦苷用于核桃油抗氧化的报道。研究对橄榄苦苷进行优化提取工艺，并研究了橄榄苦苷对核桃油的抗氧化效果，以期能为核桃油的抗氧化提供依据，并为木本油料作物的油脂产业升级提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃油：由采购于云南漾濞的核桃压榨而得；橄榄叶：云南省林业科学院采集而得。

冰乙酸、三氯甲烷、碘化钾、硫代硫酸钠、石油醚、乙酸乙酯、甲醇、可溶性淀粉、异丙醇、乙醚、氢氧化钠、酚酞均为分析纯；DPPH、TBHQ、VC、柠檬酸；橄榄苦苷：实验室自制；乙晴(色谱纯)。

1.2 仪器与设备

RG-306榨油机；FW-200高速粉碎机；RE-52AA旋转蒸发器；1200高效液相色谱仪；DHG-9240A电热鼓风干燥箱；SK2200B超声波清洗器；722可见分光光度计。

1.3 实验方法

1.3.1 核桃油的提取

直接由榨油机压榨核桃仁，再抽滤除杂而得。

1.3.2 核桃油抗氧化稳定性

1.3.2.1 核桃油预处理

依次准确称取0.015、0.03、0.045、0.06、0.075 g橄榄苦苷样品，分别加入到装有150 g核桃油的250 mL碘量瓶中，超声2 min，使橄榄苦苷与核桃油充分溶解，配成浓度分别为100、200、300、400、500 mg/kg的核桃油样。分别依次精密称取0.03 g的TBHQ、VC和柠檬酸加入到装有150 g核桃油的250 mL碘量瓶中，超声2 min，使抗氧化剂与核桃油充分溶解，配成浓度都为200 mg/kg的核桃油样作为对照，同时以不添加橄榄苦苷纯样的核桃油作为空白。将所有核桃油样置于(60±1) ℃的恒温干燥箱中，每隔2 d测定核桃油的POV、AV、DPPH、羟自由基和总抗氧化能力，观察核桃油在10 d内的氧化变质情况。

1.3.2.2 核桃油过氧化值的测定[15]

根据GB 5009.227—2016中的滴定法测定。

1.3.2.3 清除DPPH自由基能力的测定

参看文献[16]，以乙酸乙酯溶液作为调零参。

式中：Ai为样品与DPPH反应液于517 nm的吸光度；Ai0为样品与乙酸乙酯溶液于517 nm的吸光度；A0为DPPH反应液与乙酸乙酯溶液于517 nm的吸光度。

1.3.2.4 清除羟自由基能力的测定[17]

各溶液以及核桃油样的加入量按表1所示，使反应溶液总体积为15 mL。先在25 mL试管中依次加入6 mmol/L的FeSO4，6 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液，再加入适量蒸馏水，最后加0.1%的H2O2溶液，摇匀后置于37 ℃水浴锅中反应30 min，反应结束后在3 500 r/min速度下离心10 min，最后吸取上清液于510 nm波长测定吸光度。计算公式：

羟自由基清除率

1.3.2.5 总抗氧化能力的测定

参考文献[18]，在10 mL试管中分别加入不同浓度的橄榄苦苷核桃油样品200 mg/kg的TBHQ、VC、柠檬酸核桃油样，以及不添加橄榄苦苷的核桃油样，再加入3 mL FRAP工作液混匀后置于37 ℃水浴锅中反应10 min，反应结束后于593 nm波长测定吸光度。

1.3.3 响应面试验设计

由于核桃油中的金属矿物质元素较丰富，而VC、柠檬酸等有机酸主要是通过与金属离子络合，从而形成螯合物，以减弱金属离子对核桃油过氧化反应的催化，复配后使得核桃油抗氧化的效果得到增加。根据GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》，将VC、柠檬酸的添加量设在200 mg/kg最大限制使用量范围内，再综合橄榄苦苷单因素实验结果，选取橄榄苦苷的用量水平。利用响应面法建立模型，以POV值为响应值，采用BOX-Behnken设计响应实验方案。将核桃油样于(60±1) ℃的恒温干燥箱中加速氧化，测定核桃油样第10天的POV值。表2为实验因素与水平。

表2 响应面试验因素与水平

1.3.4 数据处理与分析

每个核桃油样都测3次平行，得到的数据以平均值±标准差表示，利用Excel 2003处理数据，利用Design-Expert 建立响应面模型，利用SPSS 19.0进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 橄榄苦苷对核桃油的抗氧化稳定性研究

2.1.1 不同添加量的橄榄苦苷对核桃油抗氧化能力比较

由图1可以看出，在恒温干燥箱中放置10 d后，未添加橄榄苦苷抗氧化剂的核桃油POV值高达(69.5±0.65) mmol/kg，而添加了橄榄苦苷抗氧化剂核桃油的POV值明显都比其小很多，说明橄榄苦苷有良好的抗氧化性，抗氧化效果极显著(P<0.01)。当橄榄苦苷浓度为200 mg/kg时的抗氧化效果最好，且在橄榄苦苷浓度较低时，对核桃油的抗氧化效果随着浓度的增加而增强，而后核桃油的抗氧化效果随着浓度的增加而变弱。

图1 不同浓度的橄榄苦苷核桃油样POV-时间曲线

2.1.2 橄榄苦苷与其他抗氧化剂对核桃油抗氧化能力比较

油脂氧化反应的发生有三个阶段：第一是引发阶段、接着是传递阶段、最后终止阶段[19]。第一阶段的氧化反应较缓慢，表现在POV值增幅较小，第二阶段的氧化反应速度加快，表现在POV值增幅较大，最后阶段油脂基本已经腐败变质，这时的生成的自由基已经相互结合生成新的稳定化合物。

由图2可知,空白对照和VC核桃油样经过4 d的引发期后，进入第二阶段，特别是从第6天开始快速增长，到第8天开始进入第三阶段终止期；柠檬酸核桃油样同样是经过4 d的引发期后，进入第二阶段，但是从第6天开始到第10天一直是快速增长期，还没有进入终止期；跟前面三者相比，橄榄苦苷以及TBHQ核桃油样的POV曲线变化就很小，一直比较平缓，直到第10天还没进入第二阶段传递期。各核桃油样品前期的POV值的增幅较小，变化较平稳，且在前4 d POV值升高不显著(P>0.05)。随着时间的增加，从第6天开始，VC和柠檬酸核桃油样的POV值开始大幅增加，而橄榄苦苷和TBHQ的核桃油样在恒温干燥箱中放置10 d内，POV值一直是缓慢地增长。将这几种抗氧化剂比较发现：TBHQ、橄榄苦苷VC和有极显著的抗氧化效果(P<0.01)，柠檬酸有显著的抗氧化效果(P<0.05)，即抗氧化能力大小为：TBHQ>橄榄苦苷>VC>柠檬酸。

图2 不同抗氧化剂对核桃油样抗氧化效果

2.2 橄榄苦苷对核桃油DPPH清除能力研究

2.2.1 不同添加量的橄榄苦苷对核桃油DPPH清除能力比较

DPPH是一种稳定自由基，可以清除样品中的其他自由基，因此可以通过DPPH的清除能力来说明抗氧化能力的强弱，样品溶液中紫色消失越多，清除率越大，抗氧化能力越强，最后变为黄色或无色[20]。

1.2 家庭农场在现代农业生产的优势 家庭农场的内在市场化运作方式和家庭经营的稳定性决定了在市场经济下有较高的竞争力，在发达国家，以家庭农场为经营方式的已存在近200年，今天依然为农业的最重要经营方式。我国家庭农场是在家庭承包经营基础上发展起来的，它保留了家庭承包经营的稳定性特点，同时又吸纳了现代农业市场化运作方式，其优势有以下几点。

观察图3发现，随着时间的增加，不同浓度橄榄苦苷核桃油样的DPPH清除能力也随之下降，即核桃油样氧化的时间越久，其DPPH清除能力就越小。在恒温干燥箱中放置10 d后，浓度为200 mg/kg的橄榄苦苷核桃油样的DPPH清除能力明显优于其他浓度核桃油样，为(72.5±0.38)%，说明200 mg/kg橄榄苦苷核桃油DPPH清除能力最强，有极显著的清除DPPH能力(P<0.01)。当橄榄苦苷浓度较低时，核桃油对DPPH的清除能力随着浓度的增加而增强，当橄榄苦苷浓度大于300 mg/kg时，核桃油的DPPH清除能力随着浓度的增加而变弱，清除DPPH能力变得不显著(P>0.05)。

图3 不同浓度的橄榄苦苷核桃油样DPPH-时间曲线

2.2.2 橄榄苦苷与其他抗氧化剂对核桃油DPPH清除能力比较

由图4可知，在恒温干燥箱放置10 d后，将同为200 mg/kg的抗氧化剂核桃油与空白对照相比：DPPH清除能力下降幅度最多的是柠檬酸核桃油样，最后仅为(39.6±0.56)%，VC的DPPH清除能力一直保持平稳的下降速度，最后降至(54.5±0.62)%，而橄榄苦苷与TBHQ核桃油样的DPPH清除能力下降的都比较少且速度较缓慢，橄榄苦苷为(72.5±0.38)%，TBHQ为(87.9±0.45)%,橄榄苦苷与VC的核桃油样DPPH清除能力差距变得越来越大，说明橄榄苦苷核桃油虽比TBHQ核桃油样对DPPH自由基的清除能力弱，但对DPPH自由基的清除能力极显著高于对照柠檬酸、VC和对照(P<0.01)。

图4 不同抗氧化剂的核桃油样对DPPH清除能力

2.3 橄榄苦苷对核桃油羟自由基清除能力研究

2.3.1 不同添加量的橄榄苦苷对核桃油羟自由基清除能力比较

观察图5可知，随着时间的增加，不同浓度橄榄苦苷核桃油样的·OH清除能力也在随之下降，即核桃油样氧化的时间越久，其·OH清除能力就越小。在恒温干燥箱中放置10 d后，浓度为200 mg/kg的橄榄苦苷核桃油样的·OH清除能力明显优于其他浓度核桃油样，为(76±0.62)%，说明200 mg/kg橄榄苦苷核桃油·OH清除能力最强，有极显著的清除DPPH能力(P<0.01)；还能发现，300 mg/kg的橄榄苦苷核桃油·OH的清除能力为(65.7±0.48)%，有极显著的清除DPPH能力(P<0.01)，400 mg/kg的橄榄苦苷核桃油·OH的清除能力为(53.9±0.73)%，500 mg/kg的橄榄苦苷核桃油·OH的清除能力却为(50.6±0.57)%，清除·OH的能力变得不再显著(P>0.05)，经Duncan和LSD多重比较，发现组间差异极显著(P<0.01)。

图5 不同浓度的橄榄苦苷核桃油样·OH-时间曲线

2.3.2 橄榄苦苷与其他抗氧化剂对核桃油羟自由基清除能力比较

由图6可知，几种抗氧化剂都有清除·OH的能力。一开始TBHQ核桃油样的DPPH清除能力最强，橄榄苦苷与VC的核桃油样DPPH清除能力相差不多，柠檬酸DPPH清除能力最弱，随着时间的增加，这几种抗氧化剂的核桃油样对DPPH清除能力都在随之下降，但与空白对照相比DPPH清除能力下降幅度最多的是柠檬酸核桃油样，最后仅为(39.6±0.6)%，VC的DPPH清除能力一直保持平稳的下降速度，最后降至(51.8±0.7)%，而橄榄苦苷与TBHQ核桃油样的DPPH清除能力下降的都比较少且速度较缓慢，橄榄苦苷为(75.9±0.62)%，TBHQ为(86.9±0.68)%，橄榄苦苷与VC的核桃油样DPPH清除能力差距变得越来越大。

图6 不同抗氧化剂的核桃油样对·OH清除能力

2.4 橄榄苦苷对核桃油总抗氧化能力研究

2.4.1 不同添加量的橄榄苦苷对核桃油总抗氧化能力比较

观察图7可知，100 mg/kg的橄榄苦苷核桃油总抗氧化能力为(54.79±0.36)%,有极显著的总抗氧化能力(P<0.01)，300 mg/kg的橄榄苦苷核桃油总抗氧化能力为(60.74±0.47)%，有极显著的总抗氧化能力(P<0.01)，400 mg/kg的橄榄苦苷核桃油总抗氧化能力为(50.57±0.58)%，500 mg/kg的橄榄苦苷核桃油总抗氧化能力为(42.22±0.72)%，当橄榄苦苷浓度为200 mg/kg时核桃油样的总抗氧化能力明显优于其他浓度核桃油样，总抗氧化能力为(69.6±0.55)%，说明200 mg/kg橄榄苦苷核桃油总抗氧化能力最强，总抗氧化能效果极显著(P<0.01)，经Duncan和LSD多重比较，发现组间差异极显著(P<0.01)。

图7 不同浓度的橄榄苦苷核桃油样总抗氧化能力-时间曲线

2.4.2 橄榄苦苷与其他抗氧化剂对核桃油羟自由基清除能力比较

由图8可知，这几个抗氧化剂的总抗氧化能力都在随着时间增加而变弱，其中TBHQ的总抗氧化能力随着时间的增加降低的幅度最小，将浓度同为200 mg/kg的不同抗氧化剂核桃油的总抗氧化能力作比较发现：总抗氧化能力测定的最大是TBHQ,仅为(85.9±0.36)%，橄榄苦苷次之，总抗氧化能力为(69.6±0.55)%，VC的总抗氧化能力下降稍快，总抗氧化能力为(54.5±0.68)%,而柠檬酸的总抗氧化能力下降更多,总抗氧化能力为(51.8±0.79)%；将这几种抗氧化剂与空白对照作比较发现：TBHQ、橄榄苦苷VC和有极显著的抗氧化效果(P<0.01)，柠檬酸有显著的抗氧化效果(P<0.05)。

图8 不同抗氧化剂的核桃油样总抗氧化能力

2.5 响应面优化实验结果

2.5.1 响应面实验设计及回归模型的建立

用Design-Expert软件分析表3中的数据，并建立回归模型，得到二次回归模型方程Y=4.9-0.77A-0.063B-0.45C+0.11AB-0.14AC+0.45BC+0.73A2+0.71B2+0.36C2。

表3 响应面实验设计及结果

由表4可以看出，POV模型回归显著且失拟项不显著，R2为0.925 6，说明该方程拟合良好，能解释92.56%数据的变异性。在因素水平范围内，各因素对POV值的影响顺序为：A>C>B。其中，A项对POV值的影响达到极显著水平，C项、A的二次项、B的二次项对POV值的影响达到显著水平，表明各因素对POV值并不是简单的线性关系。

表4 回归模型方差分析

注：**极显著(P<0.01)；*显著(P<0.05)。

2.5.2 回归模型的方差分析

由图9可见，当VC浓度一定时，橄榄苦苷浓度在100～300 mg/kg范围内，核桃油POV值随着浓度的增大而先减小后增大，当浓度超过200 mg/kg时随着橄榄苦苷的浓度增大，变化趋势较平缓，说明橄榄苦苷浓度超过200 mg/kg后对POV的影响变小；柠檬酸浓度在100～200 mg/kg范围内，核桃油POV值也随着浓度的增大而先减小后增大。由等高线可以发现，橄榄苦苷与柠檬酸的交互作用对核桃油POV值影响不显著。

由图10可见，当柠檬酸浓度一定时，VC浓度在100～200 mg/kg范围内，核桃油POV值随着浓度的增大而增大，榄苦苷浓度在100～300 mg/kg范围内，核桃油POV值随着浓度的增大而先减小后增大，当浓度超过200 mg/kg时随着橄榄苦苷的浓度增大。由等高线可以发现，橄榄苦苷与VC的交互作用对核桃油POV值影响不显著。

由图11可见，当橄榄苦苷浓度一定时，柠檬酸浓度在100～200 mg/kg范围内，核桃油POV值随着浓度的增大而先减小后增大；VC浓度在100～200 mg/kg范围内，核桃油POV值随着浓度的增大而增大，曲线较陡，变化速率较快。由等高线可知，橄榄苦苷与VC的交互作用对核桃油POV值影响不显著。

图9 橄榄苦苷与柠檬酸交互作用对POV影响的响应面图

图10 橄榄苦苷与VC交互作用对POV影响的响应面图

图11 柠檬酸与VC交互作用对POV影响的响应面图

2.5.3 验证实验

通过模型分析，得到优化的最佳复配组合是265 mg/kg橄榄苦苷+135 mg/kg柠檬酸+197 mg/kg VC ，POV预测值为4.45 mmol/kg。按照最佳复配组合参数进行实验，得到POV理论值为4.22 mmol/kg，理论值与预测值基本一致，这表明该模型的预测效果良好，响应面模型优化实验结果可靠。

2.5.4 抗氧化效果比较研究

TBHQ 是目前公认较为理想的油脂抗氧化剂，但随着人们对健康重视程度的加深，合成添加剂安全性受到质疑，在许多国家的食品加工中只能限制性使用。而本试验优化的复合抗氧化剂为天然抗氧化剂，无毒副作用，安全性高，且从图12可以看出,复配组合的抗氧化效果与 TBHQ 相当，因此复配抗氧化剂是核桃油理想的天然抗氧化剂组合。

图12 复配组合与抗氧化剂对核桃油抗氧化能力比较

3 结论

采用 Schaal 烘箱法以过氧化值为指标，研究橄榄叶提取物橄榄苦苷对核桃油抗氧化作用，以DPPH清除自由基能力为指标，研究橄榄苦苷对核桃油清除DPPH自由基能力的体外抗氧化活性。结果表明，橄榄苦苷对核桃油有抗氧化效果，且在添加量为200 mg/kg时效果最好；橄榄苦苷与其他抗氧化剂相比，对核桃油的抗氧化能力大小：TBHQ>橄榄苦苷>VC>柠檬酸；橄榄苦苷核桃油有较强的清除DPPH自由基能力，且200 mg/kg橄榄苦苷核桃油DPPH自由基清除能力最强，有极显著的清除DPPH能力(P<0.01)；橄榄苦苷核桃油对DPPH 自由基的清除能力极显著高于对照柠檬酸、VC和对照(P<0.01)；通过响应面优化试验，得到最优浓度配方为265 mg/kg橄榄苦苷+135 mg/kg柠檬酸+197 mg/kg VC，与TBHQ对核桃油的抗氧化效果相当，有效延长的核桃油的货架期。因此可以得到结论：橄榄苦苷是一种有效的油脂天然抗氧化剂。