立枯丝核菌选择性培养基的研究

李 悦

(安康市农业科学研究所，陕西 安康 725021)

立枯丝核菌(Rhizoctoniasolanikühn)的寄主范围非常广，据报道，在自然条件下，立枯丝核菌可以侵染200多种植物，通过人工接种的方法可以成功侵染32科的188种植物，产生多种不同的症状，例如腐烂、枯萎、猝倒，褐变等等[1]。立枯丝核菌作为一种严重危害作物的土传病原菌，以菌丝或菌核形式在土壤中残留越冬，在条件适宜的情况下侵染作物，引发病害，由立枯丝核菌引起的重要植物病害，如水稻纹枯病和玉米纹枯病，给农业生产带来了重大的损失[2]。选择性培养基是根据不同种类菌株对化学物质的敏感度不同，通过添加特定的物质来配制，用于对目的菌株进行有效筛选[3]。本研究的目的是找寻一种选择性培养基，可抑制部分常见土壤寄生菌，但不影响立枯丝核菌的生长。利用这种选择性培养基，可以有效的测定土壤中是否有立枯丝核菌的存在，通过生成的菌落预估土壤菌源量，从而积极采取措施，达到提前预防病害的目的。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试微生物：立枯丝核菌Rhizoctoniasolanikühn、黄曲霉Aspergillusflavus、黑曲霉Aspergillusnige、木霉Trichodermasp.、根霉Rhizopussp.、链格孢霉Alternariaalternata、尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum、致病疫霉Phytophtorainfestans。

主要试剂：K2HPO4、MgSO4·7H2O 、KCl 、FeSO4·7H2O 、NaNO2、氯霉素 、医用链霉素、孟加拉红，以上所用试剂均为市售分析纯。

供试农药：98%甲霜灵原药，山东沾化天元精细化工有限公司生产；95%咪鲜胺原药，湖北巨胜科技有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 选择性培养基筛选 参考已有报道配方制作基础培养基[4～5]，配方如下：K2HPO41 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；KCl 0.5 g；FeSO4·7H2O 10 mg；NaNO20.2 g；氯霉素0.05 g；琼脂20 g；蒸馏水1 000 mL。制备完成后在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20 min，在培养基冷却到50～55℃时加入0.1 g·L-1链霉素和0.035 g·L-1孟加拉红，然后分别加入以下三种混配药剂，①0.06 g·L-1甲霜灵，0.005 g·L-1咪鲜胺；②0.08 g·L-1甲霜灵，0.007 g·L-1咪鲜胺；③0.1 g·L-1甲霜灵，0.01 g·L-1咪鲜胺。

分别在培养黄曲霉、黑曲霉、木霉、根霉、链格孢霉、尖孢镰刀菌、致病疫霉和立枯丝核菌等土壤中常见病原菌的菌落边缘打取直径为5 mm的菌饼，分别移至各配方培养基平板中央，重复3次，28℃培养，以加入等量无菌水的基础培养基为对照，3 d后测量各菌块在培养基上的菌落直径，筛选出最适合立枯丝核菌的选择性培养基配方。

1.2.2 选择性培养基效果验证 将立枯丝核菌菌株接种于麦麸培养基中(50 g麦麸+50 g水的麦麸培养基中放入5块直径5 mm的菌丝块)，28℃培养14 d，每日摇动培养基若干次，备用。分别将带菌麦麸与大田土壤按照5 ∶ 5，3 ∶ 7，1 ∶ 9的体积比混匀，制成含菌量不同的带菌土，混匀后置于25℃的恒温烘箱中24 h，风干后研磨，称取0.1 g均匀地撒在已制备好的选择性培养基平板上，置于28℃培养24 h, 通过镜检确定长出的菌落是立枯丝核菌后统计菌落数。每处理测定5皿，重复3次，以无菌土作为对照。

2 结果与分析

2.1 选择性培养基筛选结果

选择性培养基的筛选试验结果如表1所示，配方1对根霉以及致病疫霉的抑制效果不理想，配方2和3均可有效抑制除立枯丝核菌以外的其它病菌的生长，但是与对照处理比较，加入药剂后的培养基对 立枯丝核菌的生长也有一定的抑制作用，配方3由于加入的药剂浓度更高，对立枯丝核菌的抑制作用更强，因此选择使用配方2作为立枯丝核菌的选择性培养基(表1 )。

2.2 选择性培养基效果验证

将培养皿置于28℃恒温箱中培养24 h后观察有白色菌落生成， 通过镜检确定长出的菌落全部是立枯丝核菌，未见其他微生物菌落。经菌落数统计，各处理土壤含菌量差异显著，各处理中加入菌源量是5 ∶ 3 ∶ 1，经选择性培养基筛选后，统计土壤菌量结果是5.70 ∶ 3.37 ∶ 1，结果近似初始加入菌源量(表2)。

表1 不同植物病原菌在3种选择性培养基上的生长情况

表2 各处理土壤中立枯丝核菌含量

3 结论与讨论

通过试验验证，配方2对除立枯丝核菌以外的其他常见土壤寄生菌有较强的抑制作用，可以作为立枯丝核菌的一种选择性培养基，利用其特殊作用将立枯丝核菌从土壤中鉴别出来。用筛选的选择性培养基测定混有不同比例带菌土中立枯丝核菌的含量，从最终结果来看，该培养基可以较为准确的测得土壤中立枯丝核菌的含量，所以在实际生产过程中，这种选择性培养基可以有效用于测定土壤中是否有立枯丝核菌的存在，通过生成的菌落预估土壤菌源量，从而积极采取预防措施，达到控制病害发生的目的。

立枯丝核菌有多个菌丝融合群，来自不同融合群的菌株之间存在一定差异，本次试验只选用了一株菌株，后期还需利用来自不同菌丝融合群的菌株进行效果验证。另外土壤中寄生菌复杂多样，本试验只选取了常见的几种，选择性培养基在实际应用过程中还可不断完善优化，确保其选择的有效性。