圆齿野鸦椿中isobiflorin和biflorin的超声提取工艺

李艳蕾, 黄闰玲, 邱亚铁, 陈景新, 张雅萍, 姚诗茹, 邹双全, 倪 林2,, 蔡文杰， 胡亚林

(1.福建农林大学林学院，福建 福州 350002；2.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002；3.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002；4.台湾成功大学热带植物研究所，台湾 台南 701)

圆齿野鸦椿(EuscaphiskonishiiHayata)为省沽油科野鸦椿属植物，又名福建野鸦椿，是我国特有珍稀药用观赏树种，富含三萜[1-3]、倍半萜[4]、酚酸类[5-6]、生物碱[7]等成分，具有抗炎镇痛、祛风除湿的药用功效[8].近年来，该树种在福建、江西等省的种植面积不断扩大，仅福建三明清流、泰宁，南平邵武、建阳，泉州德化等地就超过300 hm2.本课题组一直致力于圆齿野鸦椿药用价值的开发与利用研究，并从圆齿野鸦椿果皮中分离、鉴定出色原酮碳苷类成分isobiflorin和biflorin，且含量高于含有这两种成分的其他植物[9].已有研究表明，isobiflorin和biflorin有很强的抗炎[10]、抗氧化[11]、抗消化道功能紊乱[12]等活性.其中，抗炎活性尤为突出，15 mg·kg-1biflorin产生的药效与100 mg·kg-1布洛芬相当[10].如何有效从圆齿野鸦椿果皮中提取isobiflorin和biflorin成为当前亟待解决的问题.因此，本课题组采用响应面法[13-14]优化超声提取圆齿野鸦椿中isobiflorin和biflorin的工艺，为圆齿野鸦椿果皮提取物的高效利用提供参考，也为色原酮碳苷类化合物药用价值的开发做前期准备.

1 材料与方法

1.1 药材、药品与试剂

样品为2017年10月采收的成熟期圆齿野鸦椿果实的外果皮，采自福建三明清流圆齿野鸦椿种植基地，样品存于福建农林大学制药工程系；isobiflorin和biflorin对照品为实验室自制，其ESI-MS、1H、13C NMR数据与文献[15-16]完全一致，经HPLC测定，归一化法计算，质量分数为99%以上.甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯.

1.2 仪器

Waters W2695-W2998高效液相色谱仪(美国沃特世公司)，CPA225D型电子分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，高速多功能粉碎机(永康市天祺盛世工贸有限公司)，KQ500DE型数控超声波清洗机(昆山超声仪器公司).

1.3 isobiflorin和biflorin含量测定方法

1.3.1 HPLC分析条件 Dikma Diamonsil(C18250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇—水(25∶75)等度洗脱，检测波长256 nm，柱温30 ℃，流速1 mL·min-1，色谱条件与文献[9]相同.

1.3.2 对照品溶液制备与标准曲线的绘制 精密称取对照品isobiflorin和biflorin各2 mg，加入甲醇溶解，定容至2 mL，配制成1 mg·mL-1的对照品溶液，摇匀，备用.将配制的对照品溶液按1.3.1的条件进行检测，对照品溶液分别进样2、4、6、8、10 μL,得到相应的峰面积后绘制标准曲线.

1.3.3 圆齿野鸦椿果皮超声提取法流程 将圆齿野鸦椿果皮在50 ℃下烘干至恒重，粉碎后过筛，取粒径≤0.178 nm的粉末备用.精密称取2 g处理后的样品粉末，置于150 mL具塞锥形瓶中，加入一定体积相应浓度的乙醇，称定，超声提取(40 kHz、250 W).取出静置至室温，称定并补足质量，吸取提取液适量，过滤，取续滤液，按1.3.1的方法进样检测.

1.4 圆齿野鸦椿超声提取工艺参数的单因素试验

以isobiflorin和biflorin的总提取率为评价指标，分别考察提取时间、乙醇体积分数及液料比对提取率的影响.

isobiflorin和biflorin的总提取率/%=isobiflorin提取质量+biflorin提取质量圆齿野鸦椿药材质量×100

1.4.1 提取时间对提取率的影响 固定液料比25∶1，乙醇体积分数为50%，提取时间分别为10、20、30、40、50 min，按1.3.3的方法进行试验.

1.4.2 乙醇体积分数对提取率的影响 固定液料比25∶1，提取时间40 min,乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%，按1.3.3的方法进行试验.

1.4.3 液料比对提取率的影响 固定提取时间为40 min,乙醇体积分数为60%，液料比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，按1.3.3的方法进行试验.

1.5 响应面试验设计

表1 响应面试验因素水平Table 1 Factor level of response surface

通过单因素试验得出提取时间、乙醇体积分数、液料比3个因素的水平值(表1)，运用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken响应面设计及数据分析.共设计17个试验，中心点重复试验5次.

2 结果与分析

2.1 HPLC检测结果

据1.3.1检测得到对照品与样品色谱图(图1).

t保留=7.764 min为化合物isobiflorin；t保留=10.065 min为化合物biflorin.图1 对照品(A)与样品(B)HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance (A) and sample (B)

2.2 标准曲线

isobiflorin和biflorin的标准曲线见图2.isobiflorin的标准曲线的线性回归方程为y=7×106x+158 143，R2=0.999 9；biflorin的标准曲线的线性回归方程为y=5×106x+132 735，R2=0.999 9.

2.3 单因素试验结果

2.3.1 提取时间对提取率的影响 由图3可以看出,随着提取时间的延长，isobiflorin和biflorin的总提取率呈上升趋势，在40 min时达最大值，之后提取率下降.故选择40 min为最优超声提取时间.

图2 对照品isobiflorin和biflorin的标准曲线Fig.2 Linear range of isobiflorin and biflorin

图3 提取时间对提取率的影响Fig.3 Effect of extraction duration on extraction rate

2.3.2 乙醇体积分数对提取率的影响 由图4可以看出,乙醇体积分数对isobiflorin和biflorin提取率的影响较为显著.随着体积分数增大，提取率先升后降，当乙醇体积分数为60%时，isobiflorin和biflorin的提取率最高.故选择60%乙醇为最优提取溶液.

2.3.3 液料比对提取率的影响 由图5可知，15∶1为最优提取液料比.

图4 乙醇体积分数对提取率的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction rate

图5 液料比对提取率的影响Fig.5 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction rate

2.4 响应面分析

2.4.1 响应面回归模型建立与方差分析 根据响应面试验结果(表2)，利用Design-Expert 8.0.6软件进行二次多项式回归拟合，得到isobiflorin和biflorin提取率(Y)与提取时间(A)、乙醇体积分数(B)、液料比(C)的回归模型：Y=-3.744+2.71×10-2A+9.53×10-2B+1.06×10-1C-5.0×10-5AB-4.0×10-4AC-2.5×10-4BC-1.98×10-4A2-7.23×10-4B2-2.49×10-3C2.对该回归模型进行方差分析(表3)可知，该回归模型极显著(P<0.000 1)，失拟项不显著(P=0.289 0>0.05)，决定系数R2=0.988 6，说明该模型与试验数据拟合程度较高.

表2 响应面试验结果Table 2 Result of response surface test

表3 响应面方差分析1)Table 3 Variance analysis of response surface

1)*表示显著(P<0.05)，**表示极显著(P<0.01).

回归模型中各项的显著性：一次项A极显著(P=0.000 3<0.01)，B极显著(P<0.000 1)，C不显著(P=0.309 1>0.05)，说明影响isobiflorin和biflorin提取率的因素依次为乙醇体积分数、提取时间、液料比；二次项A2显著(P=0.004 1<0.05)，B2极显著(P<0.000 1)，C2极显著(P<0.000 1)；三次项AB交互作用不显著(P=0.335 6>0.05)，AC交互作用显著(P=0.004 4<0.05)，BC交互作用显著(P=0.036 2<0.05).总之，3个影响因子对isobiflorin和biflorin提取率的影响较为复杂，不是简单的线性关系，曲面效应显著.

2.4.2 等高线图与响应曲面图分析 由图6可以看出，提取时间与乙醇体积分数对于isobiflorin和biflorin提取率的交互作用不显著，当提取时间为40 min、乙醇体积分数为60%时，提取率达到最大；由等高线图可知，乙醇体积分数相较于提取时间对提取率的影响更为显著.从图7可以看出，提取时间与液料比对于isobiflorin和biflorin提取率的交互作用显著(P<0.05)，主要表现为当提取时间逐渐延长时，提取率先逐渐增大后趋于平稳，当液料比逐渐增大时，提取率呈先增大后减小的趋势；当提取时间为40 min、液料比为15∶1时，isobiflorin和biflorin的提取率达到最大.由图8可知，乙醇体积分数和液料比对于isobiflorin和biflorin提取率的交互作用显著(P<0.05)，当乙醇体积分数为60%、液料比为15∶1时，提取率达到最大；从等高线图可知，乙醇体积分数对提取率的影响比液料比更为显著.

图6 提取时间与乙醇体积分数对提取率影响的等高线图(左)和响应曲面图(右)Fig.6 Contour diagram (left) and response surface diagram (right) of the effect of extraction time and ethanol concentration on extraction rate

图7 提取时间与液料比对提取率影响的等高线图(左)和响应曲面图(右)Fig.7 Contour diagram (left) and response surface diagram (right) of the effect of extraction time and liquid-to-solid ratio on extraction rate

图8 乙醇体积分数与液料比对提取率影响的等高线图(左)和响应曲面图(右)Fig.8 Contour diagram (left) and response surface diagram (right) of the effect of ethanol concentration and liquid-to-solid ratio on extraction rate

2.5 验证试验

通过响应面分析得到超声提取圆齿野鸦椿中isobiflorin和biflorin的最佳工艺条件：提取时间46 min，乙醇体积分数62%，液料比15∶1，该条件下提取率的预测值为0.601%.为验证响应面法所得结果的可靠性，在上述工艺条件下试验3次.结果发现，总提取率为(0.602±0.002)%，与预测值接近，两者的相对误差为0.17%，表明响应面法建立的回归模型与真实试验结果拟合程度较高，优化的工艺条件可靠.

3 讨论

响应面设计是一种有效的统计和优化方法，与传统的均匀设计和正交设计相比，响应面法具有试验精度高、试验次数少、数学模型预测性好等优点，且能反映各因素与响应值之间的关系.故本试验以色谱图中共有峰的总峰面积为响应值，运用Design-Expert 软件进行Box-Behnken 响应面试验设计，对isobiflorin和biflorin提取工艺进行优化，最终确定超声提取圆齿野鸦椿中isobiflorin和biflorin的最佳工艺条件：提取时间46 min，乙醇体积分数62%，液料比15∶1，其提取率为0.601%.

已有文献报道，isobiflorin和biflorin存在于鳞毛蕨科粗茎鳞毛蕨(Dryopteriscrassirhizoma)[17]、石蒜科全能花(Pancratiumbiflorum)[15]、桃金娘科丁香(Syzygiumaromaticum)[16]等植物中；在现有工艺条件下，从丁香中获得的isobiflorin最多，但得率仅为0.1%，可利用率低.采用响应面法优化圆齿野鸦椿中isobiflorin和biflorin的超声提取工艺，提取率可达0.6%，且圆齿野鸦椿资源丰富，因此开发利用潜力较大.