应用傅立叶变换近红外光谱检测婴幼儿配方奶粉中的乳糖含量

何吉子，陈秀明*，梁瑞婷，李 双，张仕云，麦丽珊

（1.广东检验检疫技术中心，广东 广州 510623；2.南沙海关，广东 广州 510623；3.广东省动植物与食品进出口技术措施研究重点实验室，广东 广州 510623；4.北京师范大学 香港浸会大学联合国际学院 珠海市农产品质量与食品安全重点实验室，广东 珠海 519000）

乳糖是婴幼儿生长发育必不可少的营养物质，乳糖不但是小儿体内器官、神经、四肢、肌肉等发育及活动的动力，而且促进小儿肠道内的乳酸菌繁殖增长，在肠道中乳糖在乳酸杆菌、乳酸链球菌、多种酶及其他某些微生物的作用下生成乳酸，乳酸对小儿肠胃有调整保护作用[1-4]。乳糖还参与钙的代谢过程，促进骨骼发育，避免因缺钙而造成佝偻病[5-6]。此外，乳糖在消化系统内水解成半乳糖，能够对脑甙和粘多糖的合成起到促进作用，对婴幼儿的智力发育产生巨大影响[7]。

目前奶粉中的乳糖和蔗糖的常用检测方法是国家标准GB 5413.5—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》中的高效液相色谱法，但该方法的缺点是样品前处理耗时长、步骤繁琐等，因此，寻找一种提高检测效率的方法势在必行。

随着科技的发展，近红外光谱检测技术取得了较快的发展，该技术具备快速、制样简单、同时测定多组分、不使用有机试剂、无污染、非破坏性分析等优点[8]。国内外一些学者利用近红外光谱技术对奶粉的营养成分进行了快速检测，特定物质的扫描图谱是特定的，光谱分析能够确保分析结果的准确性，具有代表性，能够应用于奶粉的质量监控证明了该方法的可行性[9-11]。

本实验利用傅立叶变换近红外光谱（Fourier transform near-infraredspectroscopy，FT-NIR）仪快速检测婴幼儿配方奶粉中的乳糖。通过高效液相色谱（highperformance liquid chromatography，HPLC）法所测的乳糖值作为样品的校验值，用偏最小二乘法（partial least-square，PLS）选择最优光谱模型，预测未知样品的乳糖值。该方法不仅提供了较低的检出限，较宽的动态线性范围，检测和数据处理全部自动化，大大提高了工作效率，为乳糖成分的检测提供一种样品无损、操作简单、快速的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

婴幼儿配方奶粉样品94个（其中第1阶段奶粉38个，第2阶段奶粉26个，第3阶段奶粉30个，包括美赞臣、雅培、金禧羊羊、合生元等12个品牌）市售；乳糖（纯度99.9%）：天津市科密欧化学试剂开发中心；乙腈（色谱纯）：赛默飞世尔科技有限公司；硫酸锌、亚铁氰化钾（均为分析纯）上海国药集团化学试剂有限公司；Millipore-QA10纯水：美国Millipore公司。

1.2 仪器与设备

Millipore-QA10超纯水系统：广州立诺自动化设备有限公司；FT-NIRSpectrum400傅立叶变换近红外光谱仪：美国Perkin Elmer公司；LC-20高效液相色谱仪：日本岛津公司；ELSD3300奥泰蒸发光散射检测器：瑞士步琦有限公司；液相色谱柱氨基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：月旭科技（上海）股份有限公司；XPE205分析天平（感量为0.000 1 g）：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 乳糖含量的测定[12]

前处理：称取样品1.0 g于50 mL容量瓶中，加15 mL 50～60℃纯水溶解，于超声波振荡器中振荡10 min，用乙腈定容至刻度，静置数分钟，过滤。取5.0mL过滤液于10mL容量瓶中，用乙腈定容，通过0.45 μm滤膜过滤，滤液供高效液相色谱分析。

高效液相色谱条件：色谱柱为氨基柱（4.6mm×250mm，5 μm）；流动相：乙腈∶水=（70∶30，V/V）；流速：1 mL/min；柱温35℃；进样量10 μL，示差折光检测工作温度33～37℃，蒸发光散射检测工作条件为维持飘移管温度在85～90℃，维持气流量为2.5 L/min，撞击器为关闭状态。

乳糖（20 mg/mL）标准贮备液的配制：称取在94℃烘箱中干燥2 h的乳糖标样2.0 g（精确至0.1 mg），溶于纯水中，用纯水稀释至100 mL容量瓶中，冷却到室温备用。

乳糖标准曲线的制作：取10 mL容量瓶6个，分别加入乳糖标准贮备液0、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00mL，用乙腈定容至刻度。此系列乳糖标准溶液质量浓度分别为0、2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL。将配制好的系列乳糖标准溶液分别进样，进行HPLC分析。以峰面积（Y）对乳糖溶液的质量浓度（X）绘制乳糖标准曲线，得到乳糖标准曲线回归方程为y=70 932x-2 609，相关系数R2为0.999 3。

1.3.2 婴幼儿配方奶粉的近红外光谱采集

环境温度20℃，相对湿度45%，光谱扫描范围10 000～4 000 cm-1，分辨率为16 cm-1，扫描次数为32次，用Spectrum Touch软件对奶粉样品进行光谱采集及分析，重新装样并采集2次。对平均光谱进行分析，数据采样间隔为8 cm-1，分辨为4 cm-1。

用高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中乳糖作为样品的指定值，从小到大排序。在94个样品中，抽取6个样品（包括3个第1阶段，2个第2阶段，1个第3阶段）作为验证集样品数，不参与建模计算，剩余88个样品为校正集样品数，参与建立乳糖含量校正模型。为剔除无效信息，在建立模型的过程中对样品的原始近红外光谱图进行预处理。

2 结果与分析

2.1 近红外光谱采集图

婴幼儿奶粉的原始近红外图谱如图1所示，在波数为10 000～4 000 cm-1光谱扫描范围内样品具有较强的噪音，在波数为8 923.1～4 000.0 cm-1之间具有明显的特征吸收峰，沿Y轴均有基线漂移现象。测试过程中受到样品散射的影响，各光谱间的平行移动也相对明显。

图1 婴幼儿奶粉样品原始近红外图谱Fig.1 Original near infrared spectra of infant formula milk powder samples

对近红外图谱进行一阶导数（first derivative，D1）处理后，如图2所示，光谱图的吸收峰差异更加明显，沿Y轴基线漂移校正明显，但发现有个别样品偏离整体的现象，且较为杂乱。

对近红外图谱进行二阶导数（first derivative，D2）处理之后，如图3所示，虽然也有个别样品偏离整体，但是相对一阶导数（D1）处理而言，其光谱图的吸收峰较为整齐，同时加强了样品之间的光谱图吸收峰差异，定标效果明显。

图2 婴幼儿奶粉样品近红外图谱一阶导数（D1）图Fig.2 First derivative(D1)diagram of near infrared spectra of infant formula milk powder samples

2.2 不同光谱预处理方法对乳糖含量建模的影响

光谱预处理和定量模型建立采用Spectrum Touch分析软件，多元散射校正（multiplcative scatter correct，MSC）方法是目前多波长定标建模常用的一种数据处理方法。多元散射校正（MSC）可以去除近红外漫反射光谱中样品的镜面反射及不均匀性造成的噪声，消除漫反射光谱的基线及光谱的不重复性[13-15]。标准正态变量变换（standard normalizedvariate，SNV）是对每条光谱单独进行校正，一般认为它的校正能力比MSC要强，尤其是样品组分变化较大的时候。导数既可以消除基线漂移或平缓背景干扰的影响，也可以提供比原光谱更高的分辨率和更清晰的轮廓变化，从而更为细致地反映样品的光谱特征。偏最小二乘法在近红外光谱分析中得到最为广泛的应用，是多元线性回归、典型相关分析和主成分分析的完美结合[16-18]。

本实验定量预测建模数据分别用标准正态变量变换（SNV）、多元散射校正（MSC）、一阶导数（D1）、二阶导数（D2）、大气加权、平滑数等方法相互结合，通过上述方法得到最优光谱区间，利用偏最小二乘法（PLS）建立婴幼儿奶粉中乳糖含量的校正数学模型，以方差D（X）、标样估计误差（standard sample estimation error，SEE）、预测标准差（standard error of prediction，SEP）及交叉验证预测标准差（cross validation of predicted standard deviation，CVSEP）作评价模型的精密度。方差D（X）越大时，标样估计误差（SEE），预测标准差（SEP）及交叉验证预测标准差（CVSEP）就会越小，表示模型的定标效果越好，预测的精密度越高，模型越稳健[19-20]。通过Spectrum Touch分析软件，选择不同的预处理方法，所得结果有所差异。本实验挑选了5个结果理想的预处理方法进行对比，结果见表1。

表1 近红外光谱法的5个预处理方法Table1 Five pretreatment methods of near infrared spectra

由表1可知，第5种方法的组合预处理方法的方差D（X）、SEE、SEP、CVSEP分别是95.4235%、1.157、1.18和2.345，在所有预处理方法中方差D（X）为最大，标样估计误差（SEE）、预测标准差（SEP）及交叉验证预测标准差（CVSEP）为最小，模型最稳健，预测可靠性最好。因此，选用第5种方法（二阶导数（D2）+标准矢量归一化（SNV）+平滑（半宽点数9）+传输加权的光谱预处理方法）的模型作为预测乳糖值的模型。

2.3 模型的检验

本实验利用校正集样品检验乳糖的预测值（即估计值）与指定值的相关性，结果见图4。由图4可知，乳糖校正模型的相关系数R2为0.963 4，表明预测值与指定值的相关性良好。

由该模型对6个未知样品（包括3个第1阶段，2个第2阶段，1个第3阶段）进行测定的结果比较，结果见表2。由表2可知，未知样品由该模型测定的乳糖值与液相色谱分析方法测定的乳糖值的关系符合国家标准GB 5413.5—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》中的要求，因此说明该模型具有可行性。

图4 校正集样品中乳糖估计值与指定值的相关性Flg.4 Correlation between predicted values and real values of lactose content in calibration set

表2 高效液相色谱法的乳糖值与模型预测的乳糖值比较Table2 Comparison of lactose value determined by HPLC and model

2.4 模型预测能力的精密度和稳定性

由表3可知，样品的乳糖含量测定结果平均相对误差≤0.67%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）≤0.88%。结果显示，所建模型的精密度和稳定性良好。

表3 模型预测能力的精密度和稳定性检验Table3 Precision and stability test of model predictive power

3 结论

实验结果表明，采用偏最小二乘法（PLS）建立婴幼儿奶粉中乳糖含量的校正模型，选择二阶导数（D2）+标准矢量归一化（SNV）+平滑（半宽点数9）+传输加权的光谱预处理方法，模型可以达到较理想的预测精度，模型的方差D（X）、SEE、SEP、CVSEP分别为95.4235%、1.157、1.18和2.345。模型的外部验证中，模型测定的乳糖值与液相色谱分析方法测定的乳糖值的绝对误差符合国家标准GB 5413.5—2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》中的要求。模型的预测精密度和稳定性实验显示，乳糖的预测平均相对误差均≤0.67%，RSD均≤0.88%，模型有较好的精密度和稳定性。

本实验建立的傅立叶变换近红外光谱快速检测法，样品无损、操作简单、快速，能有效地运用于婴幼儿配方奶粉中乳糖的日常检测。