响应面优化细叶杜香提取工艺及抗氧化活性研究

谢 洋，李 鹏，隋 新，付 东，张晓臣

黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨 150068

细叶杜香(LedumpalustreL.)，别名白山苔、喇叭茶、狭叶杜香等，小型常绿灌木，杜鹃花科杜香属植物，主要分布于欧洲北部和中部，亚州北部及北美洲[1,2]。在我国，细叶杜香主要分布在大兴安岭地区，其分布面积约占大兴安岭林地面积的70%[3]，资源十分丰富。

杜香药用植物在原苏联现代医学中被称为杜香草，在十九世纪俄国本草中记载了杜香的医疗作用，即用带叶与花的嫩枝制成浸剂或酊剂治疗支气管炎、风湿性关节炎及百日咳[4]。经过多年的研究发现，细叶杜香含有多种活性成分，如精油、黄酮、三萜、多糖、多酚、香豆素[5-7]等，具有止咳、平喘、化痰、抗菌消炎、增强免疫力[8,9]等药理作用，可以应用于化妆品、化工、食品及医药等多个领域。据文献报道，俄罗斯及韩国的研究者们已经将杜香提取物添加到食品中制作功能食品，如饮料、冰激淋、酸奶、罐头、面条等。可见，杜香具备成为新型食品功能因子来源的潜力[10]。随着人们对自由基与健康、疾病的关系认识的发展，具有抗氧化功能的天然产物得到了研究者们的关注。张乔会等[11]研究证明了杜香多糖具有良好的抗氧化活性及热稳定性；李雪等[12]研究发现杜香叶多糖体外抗氧化活性和抗肝癌细胞增殖活性呈现出量效关系趋势。

响应面优化法是一种有效的统计和优化方法，能够用较少的实验次数对提取工艺进行较全面的分析，且优化结果更加准确，已广泛应用于天然产物提取领域[13]。目前以响应面法优化细叶杜香抗氧化物质的提取工艺尚未见报道。本研究以DPPH自由基清除率来确定提取物抗氧化效果，在单因素试验基础上，应用响应面优化了提取工艺，得到了细叶杜香抗氧化物质的得率、总黄酮及多酚含量，并以叔丁基对苯二酚为参照研究了其DPPH自由基清除能力及铁氰化钾还原能力。

1 材料与仪器

1.1 植物来源

细叶杜香枝叶于2017年4月采自黑龙江省加各达齐市，经哈尔滨工业大学王振宇教授鉴定为杜鹃花科杜香属细叶杜香。

1.2 试剂

无水甲醇、无水乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、二氯甲烷、三氯甲烷、铁氰化钾、磷酸氢钠、磷酸氢二钠、叔丁基对苯二酚(TBHQ)均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；DPPH、芦丁分析标准品(95%)、没食子酸分析标准品(99%)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 仪器

UV-2600紫外可见光分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)，HAD-E-201D旋转蒸发器(北京恒奥德仪器仪表有限公司)，BS110s电子分析天平(德国Sartorius公司)，PPV-CTRL1-CE平行合成反应仪(东京理化器械株式会社)，HBM-103流水式粉碎机(瀚博机电有限公司)。

2 实验方法

2.1 提取溶剂的筛选

将干燥后的细叶杜香粉碎后过60目筛为样品，分别取5.0 g样品加入反应瓶中，再分别加入100 mL无水乙醇、60%乙醇、30%乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、水，瓶口接冷凝装置，置于60 ℃的平行反应器中，搅拌浸提5 h，过滤，测定其DPPH自由基清除率。

2.2 抗氧化效果测定方法

本试验采用DPPH自由基清除能力来确定抗氧化效果。将2.1实验所得的多种提取物用甲醇稀释至一定浓度后，取3 mL于具塞试管中，加入3 mLDPPH甲醇溶液(DPPH浓度为2×10-4mol/L)，摇匀，30 min后用分光光度计在517 nm处测定吸光度Aa；同时测定3 mL稀释好的提取液加入3 mL甲醇混合后的吸光度Ab；以及3 mL DPPH溶液加入3 mL甲醇混合后的吸光度A0。按上述方法测定其DPPH清除率。对自由基清除率的计算方法如式(1)。

(1)

2.3 单因素实验

2.3.1 提取时间

称取细叶杜香叶粉末5.0 g加入反应瓶中，料液比为1∶30，置于平行反应器中，瓶口接冷凝装置，提取温度为70 ℃，提取时间分别为1、3、5、7、10 h，提取次数1次，过滤，测定DPPH自由基清除率。

2.3.2 提取温度

称取细叶杜香叶粉末5.0 g加入反应瓶中，料液比为1∶30，置于平行反应器中，瓶口接冷凝装置，提取温度分别为40、50、60、70、80、90 ℃，提取时间3 h，提取次数1次，过滤，测定DPPH自由基清除率。

2.3.3 料液比

称取细叶杜香叶粉末5.0 g加入反应瓶中，分别加入不同体积的异丙醇，使料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，置于平行反应器中，瓶口接冷凝装置，提取温度为70 ℃，提取时间3 h，提取次数1次，过滤，测定DPPH自由基清除率。

2.3.4 提取次数

称取细叶杜香叶粉末5.0 g加入反应瓶中，料液比为1∶30，置于平行反应器中，瓶口接冷凝装置，提取温度为70 ℃，提取时间3 h，提取次数分别为1、2、3、4次，过滤，合并提取液，将提取液浓缩至相同体积，测定DPPH自由基清除率。

2.4 响应面优化实验

根据单因素实验结果，选取对细叶杜香异丙醇提取物DPPH自由基清除率影响显著的因素，对其进行优化实验。以其DPPH自由基清除率为响应值(Y)，以提取时间(A)、提取温度(B)、液料比(C)为实验因素，利用Design Expert.8.0.5软件处理数据，采用Box-Behnken进行响应面设计，对实验结果进行回归拟合分析。

2.5 总黄酮及多酚含量测试

总黄酮测试方法参照文献[14]，多酚含量测试方法参照文献[15]。

2.6 抗氧化活性实验

利用响应面优化得到的工艺参数进行实验，将得到的提取液进行浓缩、干燥、备用。

2.6.1 DPPH自由基清除能力试验

配制待测样品质量浓度为0.01～0.32 mg/mL。按2.2测试方法进行试验，TBHQ为对照组。

2.6.2 还原能力试验

配制待测样品质量浓度为0.01～0.32 mg/mL。测试方法参照文献[16]并略有改动。分别取待测样品1 mL加入2.5 mL 0.2 mol/L pH为6.6的缓冲溶液和2.5 mL(1%，w/w)的铁氰化钾，混合均匀后于50 ℃恒温水浴中反应20 min，加入2.5 mL(10%，w/w)的三氯乙酸，离心(3 000 rpm，10 min)，取上清液2.5 mL加入另一试管，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL(0.1%，w/w)三氯化铁，10 min后测其在700 nm处的吸光度，TBHQ为对照组。

2.7 数据统计与分析

所有试验均进行重复性实验3次，取平均值及标准偏差作为最终的试验数据，用Origin 9.1及SPSS 20.0软件处理数据。

3 结果与分析

3.1 溶剂筛选实验结果

各种溶剂的细叶杜香提取液颜色及DPPH自由基清除率结果如表1所示。从表中可以看出，不同的提取溶剂得到的提取液从颜色到抗氧化效果都有明显的差异，其中石油醚提取液抗氧化效果最差，异丙醇提取液抗氧化效果最好。经Duncan极差法比较结果表明，在0.01%水平，以异丙醇为溶剂得到的细叶杜香提取液抗氧化效果最好，其次是无水乙醇，60%乙醇、30%乙醇与去离水差异不明显，石油醚为最差；在0.05%水平，仍然是异丙醇提取液抗氧化效果最好，且与其他溶剂有极显著差异，因此，本试验选用异丙醇作为最佳提取溶剂。

表1 不同溶剂的细叶杜香提取液颜色、DPPH自由基清除率结果

注：采用Duncan极差法进行显著性检验，相同大写字母表示在0.01%水平差异不显著，相同小写字母表示在0.05%水平不显著。

Note:Duncan’s Multiple Range Test.The same capital letter is not significant at 0.01% level,and the same small letter is not significant at 0.05% level.

3.2 单因素实验结果与分析

3.2.1 提取时间

提取时间对细叶杜香提取物DPPH自由基清除率的影响结果如图1所示。从图中可以看出，抗氧化效果随着随着提取时间由1 h增加到3 h时，提取物的DPPH自由基清除率有明显的上升。随着时间的延长，提取物DPPH自由基清除率开始下降，到7 h后又开始增加，这可能是由于提取时间的延长会导致热敏性物质的分解，但随着提取时间的增加又有新的抗氧化物质溶出使DPPH自由基清除率增加。考虑到提取时间过长会增加能耗，因此选择2、3、4 h三个时间为响应面设计的三个水平。

3.2.2 提取温度

提取温度对细叶杜香提取物DPPH自由基清除率的影响结果如图2所示。从图中可以看出，在提取温度由40 ℃增加至60 ℃时，随着提取温度的增加DPPH自由基清除率明显增加，在提取温度为60～70 ℃时自由基清除率变化不明显，随后随着温度的增加自由基清除率降低，这可能是由于温度升高导致热敏性物质分解造成的。因此，选择55、65、75 ℃为响应面设计的三个水平。

图1 提取时间对细叶杜香提取物DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effect of extraction time on DPPH radical scavenging rates from Ledum palustre L.extract

图2 提取温度对细叶杜香提取物DPPH自由基清除率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on DPPH radical scavenging rates from Ledum palustre L.extract

3.2.3 料液比

料液比对细叶杜香提取物DPPH自由基清除率的影响结果如图3所示。从图中可以看出，在料液比为1∶20时DPPH自由基清除率达到最高，而后随着液料比的增加清除率降低，这可能是因为料液比的增加造成了部分抗氧化物质的分解，引起了DPPH自由基清除率的下降。因此，选择料液比为1∶10、1∶20、1∶30为响应面设计的三个水平。

图3 料液比对细叶杜香提取物DPPH自由基清除率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on DPPH radical scavenging rates from Ledum palustre L.extract

3.2.4 提取次数

提取次数对细叶杜香提取物DPPH自由基清除率的影响结果如图4所示。从图中可以看出，随着提取次数增加，DPPH自由基清除率逐渐增加，提取4次时清除率最高，但是增加幅度较少，综合考虑溶剂及能源消耗，选择提取次数为1次。

图4 提取次数对细叶杜香提取物DPPH自由基清除率的影响Fig.4 Effect of extraction times on DPPH radical scavenging rates from Ledum palustre L.extract

3.3 响应面实验结果与分析

3.3.1 响应面分析方案及试验结果

根据单因素实验结果，响应面试验因素水平及编码如表2所示，设计方案及结果如表3所示。

表2 响应面试验因素水平及编码

表3 响应面试验及结果

3.3.2 二次回归模型拟合及方差分析

利用Design Expert.8.0.5软件对表3试验数据进行回归分析，获得回归模型方差分析及显著性结果如表4所示。

表4 回归模型方差分析及显著性结果

注：**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)，○表示差异不显著(P>0.05)。

Note:** ,*indicated extremely significant difference, significant difference,respectively.○ respresented not significant.

利用Design-Expert 8.0.5软件进行多元回归拟合，得到二次多项回归方程为：Y=84.31+0.25×A+0.45×B+0.098×C-0.038×A×B-7.500E-003×A×C+0.027×B×C-0.36×A2-0.57×B2-0.16×C2

由方差分析可以看出：模型P<0.000 1，表明该回归模型极显著；失拟项P>0.05，说明该模型拟合度好；拟合度R2=0.985 8，表明回归方程对Y的预测值与实际值有较好的相关性，该模型能解释98.58%响应值的变化，实验误差小。在一次项的检验中，自变量A、B极显著，自变量C显著；各变量的交互项均不显著；二次项检验均达到极显著。

各交互作用对细叶杜香提取液DPPH自由基清除率影响结果如图5所示。一般来说，在响应面图中响应面坡度越陡峭则响应值越敏感。从图中可以看出提取温度与提取时间及料液比的曲线均较陡峭，说明提取温度对DPPH自由基清除率影响最为显著。

图5 各交互作用对细叶杜香提取液DPPH自由基清除率影响的响应面图Fig.5 Response surface plots showing interaction of the factors on DPPH radical scavenging rates from Ledum palustre L.extract

3.3.3 验证实验及结果

经优化后，得到的最佳提取工艺参数为提取时间3.33 h、提取温度68.94 ℃、料液比为1∶23.26，此时DPPH自由基清除率预测值为84.45%。为方便实际操作，修正工艺参数为提取时间3.3 h、提取温度69 ℃、料液比为1∶23，经过三次重复性实验验证，DPPH自由基清除率为84.37±0.17%，与实验预测值接近，证明回归模型较为准确可靠，重复性好。按此工艺参数进行提取，将得到的提取液进行浓缩、干燥后，计算出细叶杜香抗氧化物质的得率为4.68±0.24 g/100 g原料。

3.4 总黄酮及多酚含量

芦丁标准溶液的拟合方程Y=0.551 86X+0.001 9，R2=0.999 8，线性关系良好。

没食子酸的拟合回归方程为Y=0.565 29X-0.002 37，R2=0.999 5，线性关系良好。

经计算，细叶杜香提取物中总黄酮含量为236.17±2.16 mg/g芦丁当量，多酚含量为73.97±3.18 mg/g没食子酸当量。经报道，多酚及黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗衰老等作用，因为其结构中的邻位酚羟基很容易被氧化成醌类结构[17]。可见，提取物中总黄酮及多酚含量较高，可能是其具有较好抗氧化活性的原因。

3.5 抗氧化活性试验结果与分析

3.5.1 DPPH自由基清除能力

细叶杜香抗氧化提取物和TBHQ对DPPH自由基清除能力结果如图6所示。从图中可以看出，细叶杜香抗氧化提取物具有较好的抗氧化性，且在一定范围内对DPPH自由基清除能力会随着质量浓度的增加而增加，其半数抑制浓度(IC50)为0.033 mg/mL，TBHQ IC50为0.009 7 mg/mL。

图6 细叶杜香提取物和TBHQ对DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activity of Ledum palustre L.extracts and TBHQ

3.5.2 还原能力

还原能力的测定可以检测样品是否是良好的电子供体。还原力强的物质可以提供更多的电子，除了使三价铁离子还原为二价铁离子外，还可与自由基结合，使自由基形成稳定的物质。细叶杜香抗氧化提取物和TBHQ对铁氰化钾的还原能力结果如图7所示。从图中可以看出，在样品质量浓度为0～0.32 mg/mL内对铁氰化钾还原能力呈线性增加，且线性关系良好，证明细叶杜香提取物具有一定的铁氰化钾还原能力。

图7 细叶杜香提取物和TBHQ对铁氰化钾的还原能力Fig.7 Reducing power of Ledum palustre L.extracts and TBHQ on potassium ferricyanide

4 结论

本实验首先通过溶剂筛选，利用Ducan极差法比较得到最佳提取溶剂为异丙醇。在单因素试验基础上采用响应面优化了细叶杜香抗氧化物质的提取工艺参数，结果表明，对细叶杜香提取液DPPH自由基清除率影响最大的因素是提取温度，其次是提取时间，料液比对其影响相对较小。结合实际操作，确定了最佳提取工艺条件为提取时间3.3 h、提取温度69 ℃、料液比为1∶23，在该条件下提取液的DPPH自由基清除率为84.37±0.17%，抗氧化物质的得率为4.68±0.24 g/100 g，总黄酮含量为236.17±2.16 mg/g，多酚含量为73.97±3.18 mg/g。

抗氧化活性实验结果表明，细叶杜香提取物抗氧化性能较强，且在一定质量浓度范围内，提取物对DPPH自由基清除作用呈现量效关系，IC50为0.033 mg/mL；铁氰化钾还原能力结果表明随着提取物质量浓度增加对铁氰化钾还原能力呈线性增加。若能对其中的活性成分进行分离纯化，则能有效提高其抗氧化活性，并且为其成为应用于医药、食品、化妆品等领域的新型天然抗氧化剂提供理论依据。