显齿蛇葡萄抗氧化活性与主要成分相关性研究

张命龙，彭密军*，杨秋玲，王志宏，王 翔

1广东省测试分析研究所 广东省分析测试技术公共实验室，广州 510070；2广东中测食品化妆品安全评价中心有限公司，中山 528437

显齿蛇葡萄Ampelopsisgrossedentata(Hand.Mazz.)W.T.wang，俗称茅岩莓、藤茶，主产于湖南、江西、福建等地，系一种资源丰富的类茶植物。2013年由原卫计委批准成为新食品原料。在我国已有700余年的饮用历史，其味甘淡、性凉，夏天泡茶多日不馊，民间称之为“神草”。医药学专著记载其具有清热解毒、消胀止渴、治疗黄疸肝炎等功效[1]。显齿蛇葡萄富含多酚、黄酮、鞣质、氨基酸及微量元素，尤其以二氢杨梅素(Dihydromyricetin，DMY)的高含量而著名，在其幼嫩茎叶部位含量可达15%～30%[2]。药理学实验表明显齿蛇葡萄具有抗氧化、抑菌、消炎、降糖降脂、抗肿瘤等活性[3,4]。

作为典型的药食两用型植物，显齿蛇葡萄抗氧化活性研究一直较为活跃。研究显示，显齿蛇葡萄抗氧化活性与黄酮类[5,6]和多酚类[7]可能存在关联。二氢杨梅素作为一种多酚羟基双氢黄酮醇，既属于黄酮类又属于多酚类化合物，具有较强的抗氧化活性[8]。然而基于现有研究报道，仍难以明确显齿蛇葡萄抗氧化活性与哪类成分最为相关，以及在不同抗氧化体系下各自的影响程度或贡献度如何，尚需要具体研究。

显齿蛇葡萄采用水提工艺，在提取液冷却或浓缩条件下二氢杨梅素极易析出，难以与其他水溶性成分形成均质体，所以本研究从水提液中通过重结晶分离出二氢杨梅素，制得较高纯度的粗品。同时使用两种醇水体系制备醇提物。获得四种提取物后，进行抗氧化活性评价，并检测其中的主要成分总多酚、总黄酮和二氢杨梅素，进而运用SPSS系统进行抗氧化活性与关键成分的相关性分析，探究相关程度，同时建立回归模型，旨在为显齿蛇葡萄的开发利用提供进一步的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂

1.1.1 供试材料

显齿蛇葡萄产于湖南省张家界，2017年5月采收幼嫩茎叶部位，低温烘干后保存。

1.1.2 主要试剂

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)购自阿拉丁试剂公司。二氢杨梅素标准品(阿拉丁，纯度≥98%)，没食子酸标准品(中国药检院，纯度≥95%)，甲醇(色谱级)购自默克公司，水杨酸、铁氰化钾购自麦克林公司，福林酚购自国药集团，聚酰胺树脂(100～200目)购自台州市路桥四甲生化厂，乙醇、双氧水等购自广州化学试剂厂，超氧阴离子自由基测定试剂购自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要设备

AS20500BT超声波仪(天津奥特赛恩斯有限公司)，R300旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)，小型喷雾干燥仪(上海那艾精密仪器有限公司)，UV2700紫外-可见光分光度仪(日本岛津公司)，LC-20A高效液相色谱仪，配备紫外检测器(日本岛津公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

取干燥显齿蛇葡萄叶，照文献方法进行提取[9]。趁热过滤，合并滤液，减压浓缩至原体积的1/5，浓缩液于4 ℃冰箱静置48 h，收集沉淀物，上清液经喷雾干燥得显齿蛇葡萄水提物(A.grossedentataextract-water,AGE-W)。利用二氢杨梅素易溶于乙醇和热溶冷析的特性，进行重结晶。沉淀物加入乙醇搅拌溶解，抽滤得澄清液，减压浓缩除去乙醇，浓缩物再加纯水90 ℃加热30 min，中途不断搅拌，抽滤去不溶物，滤液4 ℃静置24 h，收集沉淀，50 ℃真空干燥，得二氢杨梅素提取物(dihydromyricetin extract,DMYE)。

取干燥显齿蛇葡萄叶，分别以50%乙醇和95%乙醇溶液为溶剂，料液比1∶20，回流提取1.5 h，过滤得滤液，减压浓缩后，50 ℃真空干燥，获得两种不同醇提物：50%显齿蛇葡萄醇提物(A.grossedentataextract-50%EtOH，AGE-50EtOH)和95%显齿蛇葡萄醇提物(A.grossedentataextract-95%EtOH，AGE-95EtOH)。

1.3.2 主要成分的测定

1.3.2.1 总多酚

参照文献方法[10]进行测定。

1.3.2.2 总黄酮

称各样品0.1 g，溶解并定容至25 mL。取0.5～1 mL样液于1 g聚酰胺粉中拌匀，95 ℃水浴挥干，装入层析柱，先用20 mL苯洗脱杂质，后用甲醇洗脱黄酮组分，收集洗脱液并定容至25 mL。取1 mL洗脱液照文献方法[11]显色，测定总黄酮含量。

1.3.2.3 二氢杨梅素

参考文献方法[2]并略加改动流动相，测定各提取物二氢杨梅素含量。色谱条件：色谱柱TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相乙腈-0.1%磷酸溶液(25∶75)，流速0.8 mL/min，柱温30 ℃，波长290 nm，进样量10 μL。

称取各样品0.1～ 0.3 g于100 mL容量瓶中，溶解并定容。稀释10倍，过膜后供HPLC分析。

1.3.3 抗氧化活性实验

1.3.3.1 羟基自由基(·OH)清除率测定

利用FeSO4与H2O2反应产生·OH，水杨酸分子的苯环结构被·OH攻击后，产生具有特征吸收的2，3-二羟基苯甲酸，以反应体系的吸光值表示·OH的相对量，吸光值愈大表示·OH愈多[12]。若样品存在抗·OH成分时，使得·OH与水杨酸反应减弱，相应的产物会减少，以此表示样品对·OH的清除能力。参考文献方法[13]测定·OH清除率。每个实验处理平行3次。·OH清除率R1(%)计算公式如式(1)：

R1= [1-(As-Ab)/A0] × 100%

(1)

式中：A0— 溶剂空白测定的吸光度值；

As— 样品某浓度下测定的吸光度值；

Ab— 用水代替水杨酸钠溶液测定吸光度值(扣除样品本底)。

R2=(A0—As)/A0× 100%

(2)

式中：A0— 溶剂空白测定的吸光度值；

As— 样品某浓度下测定的吸光度值。

1.3.3.3 DPPH自由基清除率测定

DPPH是一种有机自由基，溶于乙醇后呈现紫色，在517 nm处有最强吸收，当存在自由基清除剂时，DPPH单电子被配对使溶液颜色变浅，吸光值降低，其降低程度与DPPH被清除程度存在定量关系[14]。参照文献方法[5]测定DPPH清除率。每个实验处理平行3次。以Vc作为阳性对照。DPPH清除率R3(%)公式如式(3)：

R3= [1-(As-Ab)/A0] × 100%

(3)

1.3.3.4 还原力测定

样品的抗氧化成分将铁氰化钾K3[Fe(CN)6] 还原成亚铁氰化钾K4[Fe(CN)6]，亚铁氰化钾再与Fe3+反应，生成普鲁士蓝，以700 nm处反应体系的吸光值表示还原力强度，吸光值愈大，则样品的还原力愈强[15]。参照文献[16]并做适当改进，测定还原力。吸取1 mL不同浓度的样品溶液，加入磷酸缓冲溶液(0.2 mol/L， pH6.6)2.5 mL,1% K3[Fe(CN)6] 溶液 2.5 mL于试管中混匀，在50 ℃水浴中反应 20 min，取出，流水速冷后加入10 %三氯乙酸2.5 mL，摇匀后静置10 min,加入纯水2.5 mL，0.1 % FeCl31 mL，摇匀，在700 nm处测定吸光值，以此表示还原力大小。以样品溶剂为空白，以Vc为阳性对照 。

1.4 数据分析

所有数据以平均值±标准误表示。用统计分析软件SPSS 19.0对数据进行方差分析(LSD法)、Pearson相关性分析和回归分析。

2 结果与分析

2.1 主要成分含量

由表1可知四种提取物中总黄酮、总多酚及二氢杨梅素含量差异明显。AGE-W中该三种成分含量均为最低，醇提物居中，DMYE中含量最高。对比AGE-W、AGE-50EtOH和AGE-95EtOH可发现，显齿蛇葡萄中的黄酮、多酚及二氢杨梅素更易溶解在乙醇浓度高的溶剂中，这证实了它们较好的醇溶性[9]。各提取物中二氢杨梅素为多酚和黄酮的重叠部分，除此之外，可能还含有没食子酸、没食子酰葡萄糖[17]等多酚类成分，含量约占4%～16%；以及杨梅素、槲皮素、芦丁、木犀草素等黄酮类成分[1,18]，含量约占12%～20%。同时两种醇提物中总黄酮含量明显高于总多酚，表明显齿蛇葡萄中黄酮类物质总量多于多酚类，这与文献报道[19]相符。由多酚和黄酮的结构推测，显齿蛇葡萄中可能存在一定量的非多酚类黄酮组分。

表1 不同显齿蛇葡萄提取物主要活性成分含量(n=3，%)

注：与AGE-W相比，**在P< 0.01水平，有显著差异。

Note：compared with AGE-W,**significant difference atP<0.01.

图1 二氢杨梅素标准品(a)、AGE-W(b)、AGE-50EtOH(c)、AGE-95EtOH(d)、DMYE(e)高效液相色谱图Fig.1 HPLC Chromatogram of DMY standard(a),AGE-W(b),AGE-50EtOH(c),AGE-95EtOH(d)and DMYE(e)

2.2 抗氧化活性

2.2.1 羟基自由基(·OH)清除活性

羟基自由基(·OH)是细胞代谢过程中产生的生理自由基，化学性质活泼，容易攻击蛋白质，核酸和脂质等大分子物质，从而损伤细胞的正常功能[20]。图2为不同显齿蛇葡萄提取物对·OH的清除效果。由图2可知，四种提取物对·OH均具有强烈清除作用，且呈现量效正相关，其中DMYE的清除效果最强，AGE-50EtOH和AGE-95EtOH较接近，AGE-W相对较弱。通过计算IC50可知四种提取物的·OH清除活性强弱顺序为DMYE(IC50值10.29 μg/mL)、AGE-50EtOH(24.62 μg/mL)、AGE-95EtOH(40.60 μg/mL)、AGE-W(140.31 μg/mL)，而对照样Vc的IC50为76.54 μg/mL。这表明显齿蛇葡萄醇提物清除·OH活性优于水提物，且优于Vc。

图2 不同提取物对羟基自由基(·OH)的清除效果Fig.2 Effect on ·OH scavenging of different extracts

图3 不同提取物对超氧阴离子自由基的清除效果Fig.3 Effect on scavenging of different extracts

2.2.3 DPPH清除活性

DPPH是一种较稳定的有机自由基。图4为不同显齿蛇葡萄提取物对DPPH的清除效果。由图4可知，四种提取物对DPPH均有显著清除作用，呈现明显的量效正相关。其中DMYE、AGE-50EtOH和AGE-95EtOH的最大清除率约为85%，AGE-W最大清除率约50%。表明显齿蛇葡萄醇提物DPPH清除活性强于水提物。通过计算IC50可知4种提取物DPPH清除活性强弱顺序为DMYE(IC50=6.17 μg/mL)、AGE-95EtOH(8.20 μg/mL)、AGE-50EtOH(9.27 μg/mL)、AGE-W(20.89 μg/mL)，而对照样Vc的IC50为17.93 μg/mL。这提示显齿蛇葡萄醇提物DPPH清除活性优于水提物，且优于Vc。

图4 不同提取物对DPPH的清除效果Fig.4 Effect on DPPH scavenging of different extracts

2.2.4 还原力

还原力测定用来检验样品中抗氧化成分的电子供应，通过还原作用给出电子，清除自由基，还原力越强，抗氧化性越强，因此可作为抗氧化性能的指标。图5为不同显齿蛇葡萄提取物还原力测试结果。由图5可知，四种提取物具有较强的还原能力，呈现良好的量效正相关。在实验浓度范围内，随着作用浓度增大，还原力几乎与之呈现线性正相关。总体上，DMYE还原力最强，与Vc相当，AGE-95EtOH还原力略强于AGE-50EtOH，AGE-W相对较弱。由此表明，不同显齿蛇葡萄提取物均具有抗氧化性能。

图5 不同提取物的还原力Fig.5 Reducing power of different extracts

2.3 相关性分析

2.3.1 Pearson相关分析

2.3.2 回归模型分析

回归分析侧重考察变量之间的数量变化规律，并通过一定的数学模型来表征这种关系，进而确定一个或几个变量的变化对另一个变量的影响程度。根据2.3.1的相关性分析结果选择与抗氧化活性相

表2 抗氧化活性与主要成分的Pearson相关分析结果

注：* *表示在P<0.01水平呈现显著相关，下同。

Note：* *mean significantly relevant atP<0.01,the same as below.

关系数最大的成分运用SPSS进行多模型曲线拟合，建立回归方程，见表3及图6～9。由表3可知，对于·OH清除活性，对数曲线的决定系数R2最高，且有显著性意义，故选择曲线模型建立回归方程，由SPSS分析结果得到回归方程为Y= 0.212+0.101lnX，其中X为显齿蛇葡萄提取物中二氢杨梅素浓度(μg/mL)，Y为该提取物对·OH的清除率。

对于DPPH清除活性，二次和三次曲线的决定系数R2最高，且有显著性意义，故选择二次模型建立回归方程，回归方程为Y=0.263+0.025X+0.002X2，其中X为显齿蛇葡萄提取物中总多酚浓度(μg/mL)，Y为该提取物对DPPH清除率。

对于还原力，同样是二次和三次曲线的决定系数R2最高，且有显著性意义，故选择二次模型建立回归方程，回归方程Y=0.022 + 0.01X-2.03×10-5X2，其中X为显齿蛇葡萄中总多酚浓度，Y为还原力大小。

表3 抗氧化活性实验的多模型拟合效果

图6 ·OH清除率与二氢杨梅素的曲线拟合图Fig.6 Fitting curve between ·OH scavenging rate and dihydromyricetin

图 清除率与总黄酮的曲线拟合图Fig.7 Fitting curve between scavenging rate and total flavonoids

3 结语

本文制备了四种提取物，确定总多酚、总黄酮及二氢杨梅素为考察因素，探究显齿蛇葡萄提取物抗氧化活性与它们的相关程度，并建立回归方程模型。四种提取物中AGE-W的总多酚、总黄酮和二氢杨梅素含量均最低，醇提物居中，DMYE中最高。这表明总多酚和总黄酮的醇溶性优于水溶性。AGE-50EtOH、AGE-95EtOH、DMYE提取物中该三种成分含量之和大于100%，这提示它们之间可能存在重叠组分。同时推测显齿蛇葡萄中可能存在一定量的非多酚类黄酮组分。

图8 DPPH清除率与总多酚的曲线拟合图Fig.8 Fitting curve between DPPH scavenging rate and total polyphenols

图9 还原力与总多酚的曲线拟合图Fig.9 Fitting curve between reducing power and total polyphenols

当前显齿蛇葡萄开发的产品有植物饮料、保健品(如拙牌清纯片)及药品(如显齿蛇葡萄总黄酮含片)。在进行产品开发过程中，大多采用水提或醇提工艺。极少使用其它有机试剂进行提取。本研究基于此现状，利用水或乙醇为溶剂，提取制备了四种不同的提取物，系统地考察它们的抗氧化活性，并分析其中的主要抗氧化成分。然而，多酚和黄酮的种类繁多、结构复杂，抗氧化活性的作用机制尚有待进一步阐明。