宫颈鳞癌组织中P21活化的激酶1和Sprouty相关EVH1域蛋白1表达观察

王晓，申倩倩，王焱，张俊俊

(1河南科技大学临床医学院，河南洛阳 471003；2河南科技大学第一附属医院)

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤[1,2]。现已证实高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发病的高危因素，目前已知HPV病毒有120多个型别，其中与宫颈癌发展相关的高危型HPV有18种，HPV感染主要影响转录的调控、基因组的复制及宿主细胞的转化，且HPV感染可影响多种信号通路的传导[3]。P21活化的激酶(PAK)是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)上游调控因子，参与细胞增殖和分化、细胞转化、细胞凋亡、细胞骨架系统重排、细胞周期和细胞迁移[4]。已有学者[5]研究证实PAK在肺癌、胃癌、食管癌等多肿瘤组织中呈高表达。Sprouty相关EVH1域蛋白(Spred)可抑制细胞分化，对多种生长因子诱导的Ras-ERK途径均有抑制作用；Ras-MAPK途径在细胞的生长、分裂、增殖和分化过程中起重要作用，并且该途径与多种肿瘤的发病及进展关系密切[6]。目前关于宫颈癌组织中PAK1、Spred1表达变化相关报道较少。我们检测了宫颈鳞癌组织PAK1、Spred1表达，并分析其与宫颈癌患者临床病理参数的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2013年1月～2015年12月河南科技大学第一附属医院手术及活检的宫颈组织标本154例，纳入标准：①术前3月内未接收药物治疗；②术前均未接受放疗、新辅助化疗和中药治疗；③临床病理资料完整、病例信息完整者。154例患者中年龄24～68岁，中位年龄50岁；高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染80例；其中宫颈上皮内瘤变Ⅰ级(CINⅠ)、宫颈上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级(CINⅡ～Ⅲ)患者分别为24、31例，经组织病理检查确诊为宫颈鳞癌患者59例；59例宫颈鳞癌患者中分期(采用2009年FIGO临床分期)为Ⅰ～Ⅱ期48例、Ⅲ～Ⅳ期11例，分化程度为中-低分化22例、高分化37 例，无淋巴结转移19例、有淋巴结转移29例；因非宫颈疾病行全子宫全切的正常宫颈组织标本40例为对照，中位年龄49岁。不同宫颈病变程度纳入者年龄具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准同意，纳入者或家属均签署知情同意书。

1.2 试剂与方法 兔抗人PAK1多克隆抗体bs-2277R、兔抗人Spred1多克隆抗体bs-17685R、 DAB 显色试剂盒(试剂均购于北京博奥森生物技术有限公司)。兔抗人PAK1多克隆抗体1:50倍稀释、兔抗人Spred1多克隆抗体1∶75倍稀释)；采用免疫组化法检测，严格按照试剂盒说明书步骤进行操作，阴性对照一抗使用PBS缓冲液替代，用已知阳性病理切片作为阳性对照。

1.3 宫颈鳞癌组织PAK1及Spred1检测 采用免疫组化法。所有操作均要严格按照试剂盒说明书进行。采用双盲法请2位专业病理科医师阅片。PAK1及Spred1均定位于胞质，呈棕黄色颗粒。按着色强度和阳性细胞数综合计算[7]，着色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；每个高倍镜视野计数100个细胞，随机观察10个视野，取各视野中阳性数平均值作为最终阳性细胞数，阴性为0分，<10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；着色强度和阳性细胞数相乘结果作为最终评分，≤3分判定为阴性，>3分判定为阳性。计算阳性表达率(阳性例数/总例数×100%)。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件进行统计学处理。计数资料用%表示，比较用χ2检验或Fisher精确概率法统计；PAK1及Spred1表达的相关性采用Spearman相关性分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈鳞癌组织PAK1、Spred1阳性表达率比较 CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宫颈鳞癌、正常宫颈组织PAK1的阳性表达率分别为29.17%(7/24)、58.06%(18/31)、81.36%(48/59)、17.50%(7/40)，与正常宫颈、CINⅠ组织比较，CINⅡ～Ⅲ、宫颈鳞癌组织PAK1的阳性表达率升高(P均<0.05)，与CINⅡ～Ⅲ组织比较，宫颈鳞癌组织PAK1的阳性表达率升高(P<0.05)。 CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宫颈鳞癌、正常宫颈组织Spred1的阳性表达率分别为70.08%(17/24)、32.26%(10/31)、13.55%(8/59)、90.00%(36/40)，与正常宫颈组织比较，CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宫颈鳞癌组织Spred1的阳性表达率降低(P均<0.05)，与CINⅠ组织比较，CINⅡ～Ⅲ、宫颈鳞癌组织Spred1的阳性表达率降低(P均<0.05)，与CINⅡ～Ⅲ组织比较，宫颈鳞癌组织Spred1的阳性表达率降低(P<0.05)。

2.2 PAK1、Spred1表达与宫颈鳞癌患者临床病理参数的关系 PAK1蛋白表达与宫颈鳞癌患者病理分级、有无淋巴转移有关(P均<0.05)。Spred1蛋白表达与宫颈鳞癌患者病理分级有关(P<0.05)。见表1。

表1 PAK1、Spred1表达与宫颈鳞癌临床病理参数的关系(例)

2.3 不同病变程度宫颈组织PAK1和Spred1表达相关性及其与高危型HPV感染的关系 相关性分析结果显示，不同病变程度宫颈组织PAK1与Spred1表达呈负相关(r=-0.440，P=0.000)。

不同病变程度宫颈组织PAK1与与高危型HPV感染呈正相关(r=+0.206，-2.16；P<0.05)，不同病变程度宫颈组织Spred1表达与高危型HPV感染呈负相关(r=-2.16；P<0.05)。

3 讨论

近些年随着利妥昔单抗(Mabthera)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、 吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)等分子靶向药物的临床应用，有部分肿瘤患者从中明显受益，但仍有大部分患者并未取得较好的疗效，因此，探索研究靶向治疗敏感的分子信号通路网仍是肿瘤治疗领域内的热点及难点问题。

P21 活化的激酶(p21-activated kinase，PAK)家族，是一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在信号传导通路中它是Rho家族下游的靶蛋白和MAPK上游的调节蛋白[5，8,9]，PAK家族成员根据其结构的异同可分为两大类，PAKⅠ类包括PAK1-3，主要通过结合CDC42 或Rac1被激活；PAKⅡ 类包括PAK4-6，可与CDC42结合但却不能使其被激活。PAK家族与食管癌、前列腺癌、胃癌等多种肿瘤的发展与侵袭有关。肿瘤细胞的生长和转移与多种因素相关PAK可以促进平滑肌细胞的增值和病理性血管的形成和重构，此研究证实了PAK家族在肿瘤病理性血管生成过程中的重要作用。PAK1是PAK家族最早发现且研究最多的成员，PAK1在细胞形成、运动和增殖等调节中起重要作用[10]。Chow等[11]报道 PAKl的表达与人鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)的分期和分级密切相关。在信号通路中PAK1是MAPK上游的调控因子，而根据现有研究已知，MAPK信号通路在多种肿瘤的发生发展过程中发挥了重要作用[12]。在宫颈癌中的发生发展中，MAPK途径的激活与Notch1的失调协同作用导致人乳头瘤病毒(HPV)驱动的宫颈癌侵袭[13]，Notch1在生物进化上高度保守，其活化形式NICD是多种信号通路的交汇点，Notch1在不同细胞中具有不同作用，在肿瘤的发生发展中，其主要机制是抑制肿瘤细胞的凋亡，从而诱导细胞增值[14]。Ong等[15]研究发现，PAKl抑制剂能够抑制MAPK信号通路的活化，因此，PAK1与宫颈癌的发病存在潜在关系。PAK1在妇科肿瘤的研究较少，有学者[16]研究PAK1在HeLa细胞中高表达，并且与HeLa细胞的增殖密切相关。

Spred蛋白家族是酪氨酸激酶结合蛋白[6]，可作用于多条信号通路，能够抑制多种刺激物诱导的Erk的激活，从而对细胞的生长和发育起负调控作用。Spred1定位于人基因的15q13.2上，可以特异性地抑制MAPK信号通路，但其作用位点目前尚不明确[17]。Spredl在RhoA介导的细胞运动及信号转导的调控中起关键作用，可抑制RhoA的活化，并且还可以与活化的RhoA结合，抑制其诱导的Rho激酶的激活。Miyoshi 等[18]研究指出：将Spred1基因和载体病毒整合并注入到试验大鼠体内，肿瘤的生长可被明显抑制，由此可推断，Spred1的高表达可减弱肿瘤组织的增殖能力。

本研究结果显示，在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ、宫颈癌组中，PAK1随着宫颈病变程度的加重阳性表达率升高，而PAK1蛋白的正常组与CINI组差异无统计学意义，提示宫颈病变CINⅠ可向正常组织转化；其余各组PAK1阳性表达率间差异均有统计学意义；而Spred1阳性表达率随宫颈病变程度的加重降低，提示PAK1与Spred1的表达与宫颈癌的发生发展有关，相关性分析结果显示，不同病变程度宫颈组织PAK1与Spred1表达呈负相关。说明在不同程度宫颈病变组织中可能出现了Spred1基因突变，使Spred1功能下调，从而对PAK家族的负调控作用减弱，引起PAK家族表达的上调，从而引起其下游蛋白MAPK作用的上调，导致宫颈癌的发生发展。目前研究表明信号通路Spred1/PAK1/MAPK信号通路与宫颈癌的发生发展存在相关性。其原因可能为在Spred1/PAK1/MAPK信号通路中，Spred1为抑癌基因，PAK1为促癌基因，两因子的调控呈负相关参与调节宫颈鳞癌的发生与发展；两者在信号通路中均与MAPK相关联，具体信号机制的作用靶点有仍待进一步研究探讨。或许上调Spred1为靶向蛋白，或抑制PAK1的活化，从而抑制MAPK信号通路的活化。PAK1蛋白表达与宫颈鳞癌的病理分级、淋巴转移有关，与年龄、临床分期无关；Spred1蛋白表达与宫颈鳞癌的病理分级有关，与年龄、病理分级、临床分期无关；由于Ⅲ～Ⅳ级宫颈鳞癌样本量仅11例，可能存在结果的偏差，需进一步扩大样本含量。

PAK1与Spred1高危型HPV感染的相关性分析可知不同病变程度宫颈组织PAK1与与高危型HPV感染呈正相关，不同病变程度宫颈组织Spred1表达与高危型HPV感染呈负相关。在宫颈鳞癌中，高危型HPV感染与PAK1共同促进宫颈鳞癌的发病及进展，因此治疗高危型HPV感染可有效预防宫颈鳞癌发生。

综上所述，与正常宫颈组织相比，宫颈上皮内瘤变宫、颈鳞癌组织中PAK1表达升高、Spred1表达降低；随宫颈病变程度加重，宫颈组织PAK1表达升高、Spred1表达降低。PAK1与Spred1呈负调控作用，在宫颈鳞癌的发生、发展中发挥重要作用。