来曲唑对子宫肌瘤细胞增殖凋亡的影响及其作用机制

刘珏 张潇迪 张群锋

南华大学附属第二医院妇产科（湖南衡阳421001）

研究发现，芳香化酶在子宫肌瘤组织中过度表达，是合成雌激素的重要酶［1］。高度特异性的来曲唑是人工合成的第3 代非甾体类芳香化酶抑制剂，可抑制芳香化酶而降低激素水平，进一步消除或减轻雌激素刺激肿瘤生长的作用［2-3］。目前，来曲唑已在子宫肌瘤、子宫内膜癌、乳腺癌等许多雌激素依赖性肿瘤治疗中发挥关键的作用［4］。本研究拟探讨来曲唑作用雌二醇（E2）、B 细胞淋巴瘤-2 基因（bcl⁃2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase⁃3）的表达对子宫肌瘤细胞增殖与凋亡的影响，探讨其可能的作用机制，为临床治疗子宫肌瘤提供新治疗途径与借鉴。

1 材料与方法

1.1 标本采集与细胞培养 选取2015年3月至2016年1月在南华大学附属第二医院手术切除的的8 例子宫肌瘤标本（病理学证实）。无菌条件下取肌瘤组织约1 cm3，放入4 ℃、无菌、含抗生素的PBS 缓冲液转移到细胞培养室。PBS 洗涤3 遍后剪碎至＜1 mm3，离心管内静置，去上清后加入含800 U/mL I 型胶原酶的DMEM 培养基，于37 ℃消化成单个细胞后用PBS 液终止消化。过滤细胞悬液后经1 500 r/min 离心10 min 收集细胞。加入DMEM 悬浮并接种，置于含5% CO2的37 ℃恒温箱里培养24 h 后，观察细胞贴壁的生长情况。当细胞铺满瓶底接近80%～90%时即可传代。用台盼蓝染色，观察细胞活性并记数，在24 孔细胞培养 板接种5 × 105/mL 后在含5% CO2的37 ℃恒温箱里继续培养。细胞用α⁃actin 抗体进行免疫细胞化学法染色鉴定。后续实验取对数期细胞分为5 组，空白组加入相同量的DMSO 子宫肌瘤细胞，与4 组10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L不同浓度的来曲唑组。DMSO 溶解来曲唑且浓度低于1%。

1.2 材料与试剂 胎牛血清（FBS，Hyclone 公司）；RPMI⁃1640 细胞培养液（美国GIBCOBRL）；MTT（华美生物）；二甲基亚砜（DMSO，分析纯，江苏鸿声）；Western blot 试剂、免疫荧光试剂（上海碧云天）；0.25%胰酶（吉泰科技）；免疫组化试剂（SP9000 试剂盒、DAB 显色剂）购自北京中杉金桥；台盼蓝等染色液及Triton X⁃100（10%）购自北京索莱宝；日本Takara 公司的RT⁃PCR 试剂（逆转录试剂盒、SYBR Green I Mix PCR 试剂）；RT⁃PCR 引物（上海生工）；PVDF膜（0.45 μm，美国Millipore）；来曲唑原药（美国Sigma⁃Aldridi）；兔抗人α⁃actin、bcl⁃2和caspase⁃3 抗体以及辣根过氧化物酶标记二抗（美国Santa Cruz）。

1.3 仪器与设备 3111 型CO2培养箱、CL17R 型冷冻高速离心机均购自Thermo Forma 公司；低温冰箱购自SANYO公司；上海中顺SENCO R⁃201旋转蒸发仪；苏州安泰的SW⁃CJ⁃1F 层流超净生物学工作台；美国Dynatech 公司的EPICS XL 型流式细胞仪；美国BioTek 公司的ELX808 酶联免疫检测仪；美国Bio⁃Rad 公司的蛋白印记检测系统与凝胶成像仪；Step One PLUS 荧光定量PCR 仪；罗氏480 荧光定量PCR 仪，Leica Bond⁃Max 免疫组化仪，Bio⁃Rad S1000 梯度PCR 仪；日本Olympus 公司的XPS⁃18 型倒置荧光显微镜。

1.4 试验方法

1.4.1 MTT 试验 用胰蛋白酶消化细胞后，将1×105/mL 接种于96 孔板中，封闭，铺板，调零，加入来曲唑，继续培养24、48、72 h。每日测定每组细胞的吸光值（A）值。实验终止前4 h，添加20 μL MTT试剂，继续孵育＞4 h。每孔添加200 μL DMSO，振荡10 min，测定490 nm 处A值，绘制生长曲线。细胞增殖抑制率（%）=1-（A药物组-A空白组）/（A细胞对照组-A空白组）×100%。

1.4.2 细胞凋亡率检测细胞增殖能力 来曲唑作用对数期细胞后，转移悬液，1 500 r/min离心5 min，弃上清液用PBS 洗2 次，加入400 μg/mL 碘化丙啶，10 μg/mL Rnase，300 μL Triton⁃100，每组设3 个复孔。在室温下避光染色20 min 后，流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

1.4.3 测定E2含量 来曲唑作用72 h后，3 000 r/min离心20 min，弃上清液，-20 ℃冻存。采用放射免疫法测定E2 水平。

1.4.4 逆转录聚合酶链反应技术（RT⁃PCR） 采用Trizol 试剂提取各组总RNA，并制备cDNA。将β⁃actin为内参照物，定量检测bcl⁃2、caspase⁃3 mRNA表达水平。其中，β⁃actin 引物序列，上游5′⁃CCAT⁃CATCTTGCAGGAGCG⁃3′，下游5′⁃CTGGCAGTGA⁃GCTATACTCG⁃3′；bcl⁃2 引物序列，上游5′⁃TCTG⁃GTCCCTTCCAGCTAGT⁃3′，下游5′⁃CAGGGAGGCT⁃AAGGGGTA⁃3′；Caspase⁃3 引物序列，上游5′⁃CT⁃TTCTCAAGGACCACCG⁃3′，下游5′⁃TCACTTGGCA⁃TACAAATCA⁃3′；将cDNA、引物和SYBR Green 混合，分别在94 ℃、50 s，55 ℃、50 s，72 ℃、50 s，72 ℃、10 min，循环40 次，用焦碳酸二乙酯补齐20 μL 体系。每组均设复孔3 个，每次重复3 次，对每个样品CT 值按照2⁃ΔΔCT法统计分析mRNA 表达水平。

1.4.5 Western blot 法检测bcl⁃2、Caspase⁃3 蛋白表达 检测各组总蛋白，利用8% SDS⁃PAGE 电泳50 μg总蛋白后，转膜后，用5%脱脂牛奶封闭1 h后加入一抗，4 ℃孵育12 h。TBST 清洗3 次，10 min/次，加入1∶300 稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，重复清洗，最后暗室曝光检测蛋白条带。

1.5 统计学方法 采用SPSS 16.0 进行数据统计学分析，计量资料用表示，采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 来曲唑对子宫肌瘤细胞增殖的影响 与来曲唑作用子宫肌瘤细胞增殖抑制率呈时间与浓度呈正相关（均r＞0.7，均P＜0.05）。见图1。

2.2 来曲唑对子宫肌瘤细胞凋亡率的影响 来曲唑作用子宫肌瘤细胞凋亡率呈时间与浓度呈正相关（均r＞0.8，均P＜0.05）。见图2。

2.3 来曲唑对子宫肌瘤细胞分泌E2 的影响 与来曲唑0 mol/L 组比较，随着药物浓度的增加，E2水平明显降低（P＜0.05），而来曲唑浓度呈越高E2水平越，呈浓度负相关性（均r＜-0.6，均P＜0.05）。见图3。

2.4 来曲唑对子宫肌瘤细胞bcl⁃2、caspase⁃3 表达的影响 来曲唑作用子宫肌瘤细胞72 h 后，bcl⁃2、bcl⁃2 mRNA 蛋白表达水平随来曲唑浓度增加而降低（P＜0.05），与浓度呈负相关（均r＜-0.7，均P＜0.05）；而caspase⁃3、caspase⁃3 mRNA 蛋白表达水平随来曲唑浓度增加而上升，与浓度呈正相关（均r＞0.8，均P＜0.05）。见图4、5。

图1 来曲唑对子宫肌瘤细胞增殖的影响（n=8）Fig.1 Effect of letrozole on proliferation of uterine leiomyoma cells

3 讨论

研究表明，来曲唑抑制雌激素合成后，既不会使雄激素在体内大量积蓄，也不会影响孕激素水平，同时也不会降低肾上腺皮质醇和醛固酮水平［3］。来曲唑不同于其他非甾体芳香化酶抑制剂，其结合亚铁血红蛋白中的铁原子，能可逆地抑制芳香化酶与雄激素底物结合，阻断雄激素催化为雌激素，不影响其他甾体激素生物合成［5］。人体的药代动力学研究表明［6］，口服来曲唑的生物利用度高达99.9%，可快速阻断雌激素合成路径，快速降低雌激素水平，缩小子宫及肌瘤体积；同时来曲唑半衰期长，且几乎所有代谢产物经肾脏排泄，毒副作用非常小。目前，来曲唑治疗子宫肌瘤的研究较少，鲜有系统的体外实验研究报道。

图2 来曲唑对子宫肌瘤细胞凋亡率的影响（n=8）Fig.2 Effect of letrozole on apoptosis rate of uterine leiomyoma cells

图3 来曲唑对子宫肌瘤细胞分泌E2 的影响（n=8）Fig.3 Effect of letrozole on E2 secretion in uterine leiomyoma cells

图4 Western blot 法检测各组bcl⁃2、caspase⁃3 的表达Fig.4 The expression of bcl⁃2 and caspase⁃3 in each group by western blot

WHYNOTT 等［7］研究显示，促性腺激素释放激素激动剂（GnRH⁃α）具有保护宫颈癌患者的卵巢功能，缩小肌瘤体积。SCARPELLINI 等［8］研究认为芳香化酶抑制剂在治疗晚期和复发性子宫内膜癌方面的临床益处有限，而RASDOSLAW 等［9］发现芳香化酶抑制药与老年女性患者雌激素分泌密切相关。BOGLIOLO 等［10］认为芳香化酶是合成雌激素的重要酶，影响着子宫肌瘤的发生发展。本研究组早前研究［11］发现利用来曲唑与GnRH⁃α 治疗子宫肌瘤体积均明显减小，但来曲唑治疗患者的血清学改变，GnRH⁃α 治疗患者的激素水平降低。ZHOU 等［12］研究发现来曲唑治疗能显著降低子宫肌瘤的大小和促进子宫肌瘤细胞的凋亡。本研究显示，来曲唑处理子宫肌瘤细胞后呈浓度与时间正相关。

图5 来曲唑作用子宫肌瘤细胞72 h 后对子宫肌瘤细胞bcl⁃2、Caspase⁃3 表达的影响Fig.5 Effect of letrozole on expression of bcl⁃2 and caspase⁃3 in uterine leiomyoma cells after 72 h treatment

ZHENG 等［13］研究表明bcl⁃2 在正常子宫肌层中呈低表达，在子宫肌瘤组织中呈高表达。本研究显示来曲唑能抑制子宫肌瘤细胞增殖，促进其凋亡。另外，本研究还发现来曲唑作用子宫肌瘤细胞表现出与浓度呈正相关，其机制可能与来曲唑下调bcl⁃2 表达和上调caspase⁃3 表达有关。此外，本研究亦发现来曲唑显著性降低了子宫肌瘤细胞E2 水平。因此，推测高浓度来曲唑除了抑制芳香化酶的表达，降低E2 合成，抑制肌瘤细胞增殖，还可能存在直接诱导细胞凋亡的作用，其能否直接诱导子宫肌瘤细胞的凋亡及其机制，有待进一步研究。

综上所述，来曲唑可能的通过下调bcl⁃2 和上调caspase⁃3 表达及降低E2 水平，来发挥抑制子宫肌瘤细胞增殖，促进其凋亡。但来曲唑抑制子宫肌瘤细胞增殖促进凋亡的机制有待更多的作用途径与信号通路的深入研究。