高危型人乳头瘤病毒载量和调节性T 细胞对宫颈癌诊断阈值的确定和意义

余杨 付艳丽 卫玮 何利珍 孙翔

河南理工大学第一附属医院（河南省焦作市第二人民医院）检验科（河南焦作454100）

研究表明，近100%的宫颈癌由人乳头瘤病毒（HPV）感染所致［1-2］，宫颈癌发生隐匿，缓慢演进，癌前病变即宫颈上皮内瘤变（CIN）阶段明显，不同临床分期的宫颈癌5年生存率相差极大，Ⅰ～Ⅱ期高达80%～90%，Ⅲ～Ⅳ期降至30%～40%［3-4］，因此，宫颈癌和CIN 的早期筛查、诊疗不仅可行且至关重要。宫颈癌病因明确，但发病过程仍有许多不确定因素，发病机制尚不完全明了，目前已达成的共识：HPV 诱导恶性肿瘤发生不是病毒生命周期中的必然事件，不能用单一理论确切解释，有关宫颈癌的研究多集中于HPV、宿主、环境这三方面。HPV 的检测已经由基因分型以降低漏检率的初筛拓展为病毒复制、蛋白表达、表观修饰等更注重特异性的精准检验［5-7］，宫颈局部免疫微环境研究是基于HPV“非溶细胞”病毒，具有高度组织特异性等自然特性，由免疫抑制细胞构筑的免疫抑制微环境可通过免疫耐受、免疫逃逸等机制促进HPV 持续感染和宫颈病变进展因而备受关注［8］。调节性T 细胞（Treg）是一群发挥外周耐受和免疫抑制功能独特的辅助性T 细胞亚群，叉头翼状螺旋转录因子3（Foxp3）是Treg 的特征性分子标志，在多方面对肿瘤免疫应答从启动识别到产生效应的整个阶段全程调控，但将肿瘤抗原HPV 的复制增殖和CD4+CD25+Foxp3+调节性T 细胞（Treg）与宫颈癌的发生进行量效联系的研究及其诊断阈值确定的报道较少。本实验分析高危型HPV 载量（HR⁃HPV DNA）和CD4+CD25+Foxp3+Treg 作为宫颈癌诊断指标的可行性，研究两指标单一和联合检测的诊断性能，确定高灵敏性和高特异性的最佳阈值，探讨最优模式在宫颈癌的临床意义，同时考虑到HR⁃HPV 载量是针对DNA 的检测，而HPV E6/E7 mRNA 能较好地反映HPV 致癌基因E6/E7 的表达［6］，故对三个指标间的关系进行了简单分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我院2012年1月至2015年9月经液基薄层细胞检测技术（TCT）筛查、HPV 基因分型检测（PCR-反向点杂交法），最终宫颈病理活检三阶梯程序确诊的HR⁃HPV 持续性感染的不同宫颈病变病例，包括CIN I 71 例、CIN II 66 例、CIN III 77 例，宫颈癌125 例，年龄范围34～62 岁，中位年龄46.43 岁，不同宫颈病变组的年龄无显著差异，具有可比性。HR⁃HPV 以16 型、52 型、58 型为主，其次31 型、33 型，其余为少见分型。排除标准：（1）孕妇；（2）合并其他恶性肿瘤或自身免疫性疾病；（3）近期使用过免疫抑制类药物；（4）HIV 阳性；（5）有放化疗史；（6）2 周内接受过局部或全身抗病毒药物治疗。持续性HR⁃HPV 感染的定义［9-10］：HR⁃HPV 感染者第1年随访1 次/4 个月，以后至少1 次/6 个月，在间隔6～12 个月的相邻2 次随访中，同一患者的宫颈检测样本均显示HR⁃HPV 阳性且为同型，持续时间2年以上，避免短期内重复取样，间隔时间至少2 个月。患者知情同意，随访资料完整。

1.2 主要仪器与试剂 采用美国BD FACS Calibur双激光流式细胞仪，配有BD CellQuest 软件。鼠抗人FITC⁃CD4 单克隆抗体、鼠抗人PE⁃CD25 单克隆抗体、鼠抗人PE⁃Cy5⁃Foxp3 单克隆抗体均购自美国eBioscience 公司。PCR 扩增仪DA7600 型和HR⁃HPV 核酸定量（16、18、31、33、45、52、56、58 共8 型）检测试剂盒均由中山大学达安基因公司提供。QuantiVirusTM便携式冷光仪和HR⁃HPV E6/E7 mRNA（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 共14 型）检测试剂盒均购自科蒂亚（新乡）生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采用宫颈刷检物制备宫颈病变单细胞悬液 选择月经后半周期进行取样，用阴道窥器充分暴露宫颈阴道部，干棉球拭净宫颈口过多的黏液、分泌物和血液，观察宫颈，将刷头置于宫颈管，其中央较长的刷丝针对新鲜病变部位，顺时针旋转3～5 圈，取下刷头，并将其浸泡在含液基细胞学保存液的瓶中，用溶血剂去除血液，再用300 目尼龙网过滤杂质，标本转入试管离心5 min（402×g），弃上清液，PBS 洗涤，密度梯度离心法分离获取单个核细胞，进行细胞计数，≥106个。

1.3.2 流式细胞仪检测单细胞悬液中Treg 细胞调整细胞浓度至（1～2）× 107个/mL，用PBS 洗涤、重悬，取上述细胞100 μL，加入FITC⁃CD4、PE⁃CD25各5 μL，混匀，室温避光20 min，加冷固定破膜剂1 mL，4 ℃避光孵育30 min，加破膜缓冲液2 mL，洗涤2 次，弃上清，加PE⁃Cy5⁃Foxp3 抗体进行细胞内染色，4 h 内进行流式细胞仪检测。用空白管调节电压，以CD25 同型对照调节补偿，确定CD4+CD25+细胞群，再以CD4+CD25+细胞设门，以Foxp3 同型对照确定阳性信号，最后测定CD4CD25Foxp3 管，检测CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+细胞中的百分率。

1.3.3 HPV DNA 定量检测 无菌条件下采用宫颈刷插入宫颈内，旋转数周后停留片刻取出，将宫颈刷置入无菌管，采集的宫颈分泌物及时送检或4 ℃保存，1 周内检测。DNA 提取和PCR 扩增按其说明书（PCR 荧光法）进行具体操作。判断标准：HPV⁃DNA＞103copies/mL 为阳性。

1.3.4 HPV E6/E7 mRNA检测 取样同HPV DNA，采用支链DNA（branch⁃DNA，bDNA）信号扩增法，按照说明书进行如下操作，先将样品离心5 min（1 610×g），弃上清，加入2 mL 双蒸水清洗，再次离心，弃上清，加入裂解液混匀，再加入蛋白酶K，65 ℃孵育1 h，留取上清，再经过布板、信号放大、添加底物等过程后放置冷光仪检测，得到光子数后经软件转化为mRNA 拷贝数，以mRNA 拷贝数≥1 copy/mL 为阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0 软件进行统计学分析。病毒载量经log 转换，两指标联合包括并联（任一指标阳性）和串联（两指标同时阳性），计算公式：（1）灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100%，特异度=真阴性/（真阴性＋假阳性）×100%；（2）并联：灵敏度=A 灵敏度+（1-A 灵敏度）×B 灵敏度，特异度=A 特异度×B 特异度；（3）串联：灵敏度=A 灵敏度×B 灵敏度，特异度=A 特异度+（1-A 特异度）×B 特异度。以病理组织活检为金标准，绘制受试者工作特性曲线（ROC），比较HR⁃HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 单独和联合诊断宫颈癌的曲线下面积（AUC），确定最佳阈值，采用诊断试验四格表法计算评价指标（灵敏度和特异度），预测指标（阳性预测值和阴性预测值）和综合评价指标（正确率、阳性似然比、阴性似然比、Youden 指数）。采用Pearson 线性相关分析上述两指标与HPV E6/E7mRNA 表达水平之间的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 绘制HR⁃HPV DNA标准曲线 PCR荧光法阈值设定原则是值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线（图1）的最高点，且循环阈值（Ct）不出现任何数值。以标准品4个浓度（1×103～1×106copies/mL）的对数值为横坐标，Ct 值为纵坐标，绘制标准曲线（图2）。Ct 值与样本起始模板的拷贝数呈正相关，与起始模板拷贝数对数值间有严格的线性反比关系。

图1 PCR 荧光法检测HR⁃HPV DNA 的扩增曲线Fig.1 Amplification curve of HR⁃HPV DNA detection by PCR fluorescence method

图2 PCR 荧光法检测HR⁃HPV DNA 的标准曲线Fig.2 Standard curve of HR⁃HPV DNA detection by PCR fluorescence method

2.2 HR⁃HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和两指标联合检测对宫颈癌的诊断效能评价 以HR⁃HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和两指标联合为检验变量，随访期限内是否发生宫颈癌为状态变量，绘制ROC 曲线（图3），HR⁃HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和两指标联检的AUC 分别为0.615、0.805 和0.825（均P＜0.05，表1）。不同水平的HR⁃HPV DNA 和CD4+CD25+Foxp3+Treg 诊断宫颈癌的准确性参数见表2，其最佳阈值（灵敏度+特异度最大）分别为6.015 和7.995%，以此为截断点，HR⁃HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg、两项并联和串联诊断宫颈癌的效能评价：（1）真实性：灵敏度分别为56.0%、80.8%、93.3%和47.5%，特异度分别为78.5%、74.3%、58.3%和94.5%，阳性似然比分别为2.605、3.144、2.237 和8.636，阴性似然比分别为0.561、0.258、0.115 和0.556，YI 分别为0.345、0.591、0.516 和0.420。（2）收益性：阳性预测值分别为60.3%、64.8%、56.3%和83.1%，阴性预测值分别为75.3%、89.3%、93.2%和75.4%。（3）可靠性：正确率分别为72.3%、80.0%、72.9%和79.3%（表3）。

图3 HR⁃HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和两指标联检诊断宫颈癌的ROC 曲线Fig.3 ROC Curve of HR⁃HPV DNA，CD4+CD25+Foxp3+Treg and the combined diagnosis of cervical cancer

表1 HR⁃HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和两指标联检诊断宫颈癌的AUCTab.1 Area under the curve of HR⁃HPV DNA，CD4+CD25+Foxp3+Treg and the combined diagnosis of cervical cancer

2.3 线性相关分析结果 经Pearson 线性相关分析，HPV E6/E7 mRNA 表达水平与HR⁃HPV DNA 和CD4+CD25+Foxp3+Treg 均具有正相关性，相关系数依次为0.583 和0.601，均P=0.000。

表2 不同水平的HR⁃HPV DNA 和CD4+CD25+Foxp3+Treg 诊断宫颈癌的准确性参数Tab.2 Accuracy parameters of HR⁃HPV DNA and CD4+CD25+Foxp3+Treg in the diagnosis of cervical cancer at different levels

表3 HR⁃HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和两指标联合检测诊断宫颈癌的效能评价比较Tab.3 Effectiveness evaluation comparison among HR⁃HPV DNA，CD4+CD25+Foxp3+Treg and the two indicators in the diagnosis of cervical cancer

3 讨论

宫颈癌的生物标志物多种多样，临床常规项目的HPV 基因型检测具有高灵敏度（优于TCT 92.6%vs.66.0%）［11］、高阴性预测度、高检测效率的优势，可明显降低宫颈癌的漏诊率，但HPV 感染的普遍性和自限性特点，使得HPV 检测特异度低，阳性预测度不高，仅能提示感染，更适合初筛，不能确定是否宫颈病变，更无法对宫颈病变的严重程度、发展转归方向提供精准信息，可能造成或盲目或过度的治疗，而缺乏前瞻性预判很可能错过CIN到浸润癌的关键节点。宫颈癌发生发展是多因素调控的复杂过程，仅仅HPV 诱导细胞内DNA 突变是不够的，还需在慢性炎症的持续刺激下不断累积变异，再加上微环境改变肿瘤细胞的生物学特性，促发恶性特征转化的强大激活信号，基因组、微环境、炎症和免疫体系发生改变的综合结果导致了癌变的风险［12-13］，因此，基于HPV 感染并能方便无创、准确量化地反映宫颈癌生物学行为变化趋势的标志物是临床重点。

本实验结果显示：HR⁃HPV DNA、CD4+CD25+Foxp3+Treg 和两指标联检的AUC，均具有对宫颈癌的预测价值（均P＜0.05），但HR⁃HPV DNA 的AUC在0.6～0.8之间，准确性中等偏下，明显低于Treg，提示HR⁃HPV DNA 在宫颈癌诊断上存在一定局限。HR⁃HPV DNA 与宫颈癌的关系上尚存一定的争议，有的研究认为HPV 载量与宫颈癌正向相关［5］，但也有不同的报道认为HR⁃HPV 病毒载量与CIN和宫颈癌发生有关，但与病变的严重程度无关［14］，除外HR⁃HPV 类型和单一/多重感染的复杂性，机体的反应差异性，一方面病毒复制不一定与样本采集恰在同一时间点，且HR⁃HPV 病毒检测多是游离和整合状态下总的HPV，不能完全反映HPV病毒的整合状态，另一方面在高载量慢性病毒感染性疾病中，T 细胞发生表型及功能的缺陷，最终出现T 细胞耗竭，因此病变进展到高级别CIN 和宫颈癌阶段后，细胞的恶性转化可能不再依赖高载量的HR⁃HPV，反而是免疫抑制状态下HPV 拷贝数有增加的可能［15-16］，而由本实验上述两指标联合后准确性并未大幅提升也可看出HR⁃HPV DNA的诊断效能欠佳以及宫颈局部免疫抑制作用较HR⁃HPV 持续感染的重大，HR⁃HPV 持续感染是宫颈癌发生的启动因素，同时还需其他因素协同维持。本实验数据显示，HR⁃HPV DNA 在最佳阈值时有相对略高的诊断特异度，灵敏度和阳性预测值较低，若以6.241 为截断点，灵敏度和特异度与最佳阈值时相差不大，而在6.375 截断点，特异度虽有上升，但灵敏度降至46.4%，显示患癌者和非癌者区间较易发生重叠，整体而言HR⁃HPV DNA不是准确预测宫颈癌发生很好的指标，但在略高的病毒载量小范围仍有预警作用，阴性预测值仅为中等偏下水平，不是排除宫颈癌的可靠指标，有证据表明［17-18］，慢性炎症可触发促炎介质和免疫抑制细胞的积聚，激活或加重免疫抑制，诱导和促进肿瘤发生发展，且本研究发现HR⁃HPV DNA 与反映HPV 致癌基因恶性转化的HPV E6/E7 显著正相关，因此，笔者认为高载量的HR⁃HPV 更易诱发慢性炎症，增加细胞恶化的风险，对较高载量的病毒携带者应加强监测。

CD4+CD25+Foxp3+Treg 预测宫颈癌的准确性较高，诊断宫颈癌的最佳阈值为7.995，在此截断点有较高的诊断灵敏度和阴性预测值，特异度略低于HR⁃HPV DNA，它的正确率和YI 均高于病毒载量和两指标联检，显现了其作为诊断指标的可靠性和正确符合率。研究发现，肿瘤微环境具有的异质性，不仅影响CD4+CD25+Foxp3+Treg 的表达水平，且发挥的生物学功能存在致病性差异，一方面免疫逃逸导致机体对肿瘤的免疫无应答或免疫反应低下，广泛抑制抗肿瘤免疫反应［19］；另一方面，对持续炎症刺激形成保护性生理防御反应，在防止过强的免疫损伤和清除病原体之间维持平衡，在病毒感染过程中可使组织损伤程度最小化［20-21］。本实验的研究对象为HR⁃HPV 持续感染者，高度的炎性环境也可上调Treg 的表达，这可能是其特异性和阳性预测值不高的原因，虽不能反映病情的严重程度，但能灵敏地提示免疫调控趋势变化与宫颈癌的关系，适合监测评估癌症发展进程和机体的细胞免疫状态。若以8.250 0 为截断点，预测宫颈癌的灵敏度和特异度有明显变化，分别为70.8%和88.8%，特异度显著提升，灵敏度亦在可接受的中等水平范围内，阳性预测值78.6%，阴性预测值83.7%，正确率、YI 分别为82.9%和0.596，综合评价诊断价值高于最佳阈值。选择最佳灵敏度-特异度平衡所产生的临界点7.995 抑或更高特异性兼顾敏感度的临界点8.250 作为CD4+CD25+Foxp3+Treg 的阳性临界值，笔者建议一是将7.995～8.250 设为灰区，结合其他生物学指标，定期复检；二是对一过性感染者可选择较低的7.995 0，以增加灵敏度，减少漏诊率，对持续感染者可选择较高的8.250 0，以增加特异度，减少误诊和过度诊疗的可能。文献报道也有相近的结论，持续感染者较一过性感染者Treg 细胞数量增加更明显，其细胞免疫受抑制的程度更显著［22-23］，在临床实际工作中，应结合受试人群特征（如年龄、发病率等）、不同筛检目的设置一个相对合理的临界点，或偏重灵敏度或偏重特异度，以提高检测的相对准确性。

肿瘤细胞发展过程中不可避免地表达一些抗原，这些抗原或通过免疫监视被清除，或通过免疫逃逸形成持续性感染，均会触发机体抗瘤/抑瘤两种截然不同的免疫应答，这是本实验将HR⁃HPV DNA 和Treg 联合检验的理论依据，样本均来自同一微环境，减少了异质性的干扰，对抗原和免疫状态进行同步监测，反应了两者相互作用导致的病变消长，结果显示：两指标并联时的灵敏度高达93.3%，阴性预测值93.2%，串联时的特异度高达94.5%，阳性预测值83.1%，因此，在实际工作中有两指标联检的必要性，选择并联还是串联，可适具体情况而定，在特定人群的筛查上可选择灵敏度高的并联实验以减少漏诊率，其极高的阴性预测值高说明在排除疾病方面是合理和可靠的方法，若是作为确诊指标串联实验为最佳模式。