香叶木素降低NLRP3炎性小体活性缓解CCl4诱导的肝损伤大鼠肝纤维化①

崔东娟 刘 涛 赵艳红

(商丘医学高等专科学校，基础医学部解剖学教研室，商丘 476000)

肝纤维化是病毒性肝炎、药物性肝损伤、脂肪肝等多种慢性肝病的共同病理过程，是指在各种致病因素的作用下，肝脏发生损伤及炎性反应，造成肝细胞坏死和凋亡，细胞外基质分泌增加，使细胞外基质的生产与溶解之间失去平衡，导致过多的细胞外基质在肝内沉积而引发的一系列病理改变，可发展为肝硬化甚至肝肿瘤[1]。肝纤维化的发病率和死亡率都很高，且呈现逐年上升的趋势，已成为一个亟待解决的医学问题[2,3]。有效抑制肝纤维化的发生和发展对肝病的治疗具有重要意义。越来越多的研究表明植物提取物在各类疾病的治疗中具有积极作用，黄酮类化合物是水果、蔬菜、茶叶和可可中主要的活性植物成分之一，在肝保护、过敏反应和病毒感染等方面发挥着重要作用。香叶木素是黄酮苷香叶木甙的糖苷配基，发现于金合欢和橄榄叶中，具有多种药理学活性，如抗癌、抗菌、抗氧化及抗炎等[4]。但关于香叶木素在肝纤维化中的作用研究还比较匮乏。本研究主要目的是探究香叶木素对CCl4诱导的肝损伤大鼠肝纤维化的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及主要试剂 7周龄SD大鼠购自中国科学院实验动物中心。CCl4购自国药集团化学试剂有限公司。香叶木素(HPLC≥98%)、苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色液和改良型Masson 三色染色液购自Solarbio公司。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling，TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司。抗细胞增殖核抗原-67(Antigen identified by monoclonal antibody，Ki-67)抗体、抗含pyrin结构域NOD 样受体家族3 (NOD-like receptor family， pyrin domain containing 3，NLRP3)抗体、抗凋亡相关微粒蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)抗体、抗Caspase 1抗体和抗白细胞介素(Interleukin，IL)-1β抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及药物处理 香叶木素用DMSO溶解配制成1 mg/ml的溶液待用。实验大鼠随机分为4组：对照组；香叶木素(DM)组；CCl4组；CCl4+ DM组。首先CCl4组和CCl4+ DM组皮下注射40%的CCl4橄榄油溶液(1.5 ml/kg)，2周一次连续8周，对照组和DM组皮下注射等量的橄榄油。上述处理的倒数第6天开始，DM组和CCl4+ DM组每天腹腔注射香叶木素(20 mg/kg)，对照组和CCl4组用生理盐水代替。

1.2.2HE染色 首先将肝脏左叶用4%的多聚甲醛于4°C下固定24 h。PBS清洗3次后用30%、50%和70%的酒精梯度脱水，每个梯度脱水10 min。去除酒精后，组织块于脱水机中脱水，然后进行石蜡包埋和切片。最后按照HE染色液说明书进行HE染色。光镜下观察肝脏组织病变情况。

1.2.3免疫组化染色 各组大鼠肝脏组织的石蜡切片经脱蜡再水化后，用1%的Triton-100通透15 min，再用3%的H2O2处理15 min。经5%的羊血清封闭30 min后再加入抗Ki67抗体(0.5 μg/ml)，4℃过夜孵育，第二天加入二抗，于37℃孵育30 min。最后进行染色封片观察。

1.2.4TUNEL 按照试剂盒说明书首先对石蜡切片进行预处理，石蜡切片依次进行二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化，再用蛋白酶K于20～37℃处理15～30 min。PBS漂洗3次后用3%的H2O2于室温孵育20 min，随后PBS清洗3次。然后进行生物素标记，显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明。最后中性树胶封片，显微镜下观察拍照，细胞核呈棕色颗粒的为凋亡细胞。

1.2.5Masson染色 石蜡切片常规脱蜡至水后，按照改良型Masson 三色染色液说明书进行染色。首先切片放入Bouin 液于37℃的温箱内进行媒染2 h，水冲洗至切片上的黄色消失。然后进行天青石蓝染色液滴染，Mayer 苏木素染色液滴染，酸性乙醇分化，丽春红品红染色液滴染。最后蒸馏水稍漂洗后磷钼酸溶液处理约10 min后于苯胺蓝染色液染色5 min，弱酸溶液处理后乙醇脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察拍照，胶原纤维呈蓝色，肌纤维、胞质、纤维素、角蛋白和红细胞呈红色，胞核呈蓝褐色。

1.2.6蛋白印迹 首先用PBS将待测肝脏组织细胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液进行总蛋白提取，100℃变性5 min。然后取等量(30 μg)蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，5%的BSA封闭1 h后加入相应的一抗：抗NLRP3抗体(1 μg/ml)，抗ASC抗体(1 μg/ml)，抗Caspase 1抗体(12 μg/ml)，抗IL-1β抗体(0.2 μg/ml)，4℃过夜孵育。第二天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液置于凝胶成像仪中，进行曝光拍照，统计灰度值后计算相对表达量。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1香叶木素对CCl4诱导的肝损伤大鼠肝脏组织病变的影响 利用HE染色观察香叶木素对CCl4诱导的肝损伤大鼠肝脏组织病变的影响。如图1所示，对照组和DM组肝脏组织细胞排列规则有序，无充血及坏死等病理学变化。CCl4组出现肝脏组织细胞排列紊乱无序、充血、细胞质空泡化、肝细胞坏死等病理变化。CCl4+DM组没有观察到明显的肝脏组织病变。由此可见，香叶木素可减轻CCl4诱导的肝损伤大鼠肝脏组织病变。

2.2香叶木素对CCl4诱导的肝损伤大鼠细胞增殖的影响 通过免疫组化染色检测肝脏组织中增殖相关蛋白Ki67的表达，分析香叶木素对CCl4诱导的肝损伤大鼠细胞增殖的影响。图2显示，CCl4组Ki67的表达明显低于对照组(P<0.05)。CCl4+DM组Ki67的表达明显高于CCl4组(P<0.05)。以上结果说明，香叶木素可增强CCl4诱导的肝损伤大鼠细胞增殖。

2.3香叶木素对CCl4诱导的肝损伤大鼠细胞凋亡的影响 利用TUNEL染色分析香叶木素对CCl4诱导的肝损伤大鼠细胞凋亡的影响。由图3可知，CCl4组细胞凋亡明显高于对照组(P<0.05)。与CCl4组相比，CCl4+DM组细胞凋亡明显下降P<0.05)。上述结果表明，香叶木素可减弱CCl4诱导的肝损伤大鼠细胞凋亡。

2.4香叶木素对CCl4诱导的肝损伤大鼠肝纤维化的影响 通过Masson三色染色分析香叶木素对Cl4诱导的肝损伤大鼠肝纤维化的影响。如图4所示，对照组和DM组未见明显的肝纤维化现象，CCl4组肝纤维化程度十分严重，CCl4+DM组肝纤维化现象得到明显改善。以上结果说明，香叶木素可缓解CCl4诱导的肝损伤大鼠肝纤维化。

图1 HE染色观察肝脏组织病变(×200)Fig.1 Pathological changes of liver tissues were observed by HE staining (×200)

图2 免疫组化染色检测Ki67表达Fig.2 Expression of Ki67 was detected by immunohisto-chemical staining

图3 TUNEL检测细胞凋亡Fig.3 Apoptosis was measured by TUNEL

图4 Masson染色观察肝纤维化(×200)Fig.4 Hepatic fibrosis was observed by masson staining (×200)

图5 蛋白印迹检测NLRP3炎性小体相关蛋白表达Fig.5 Expression of NLRP3 inflammasome related protein was detected by Western blot

2.5香叶木素对CCl4诱导的肝损伤大鼠NLRP3炎性小体相关蛋白表达的影响 为探究香叶木素可改善CCl4诱导的肝损伤大鼠肝纤维化的分子机制，蛋白印迹检测NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase 1(活化型)和IL-1β的表达。图5显示，CCl4组NLRP3、ASC、Caspase 1和IL-1β的表达明显高于对照组(P<0.05)。与CCl4组相比，CCl4+DM组NLRP3、ASC、Caspase 1和IL-1β表达明显下降(P<0.05)。由此可见，香叶木素可降低CCl4诱导的肝损伤大鼠NLRP3炎性小体信号通路活化。

3 讨论

目前治疗肝纤维化的主要策略包括：减少原发性疾病、抑制肝细胞凋亡、减弱炎症反应[5,6]。前人研究表明类固醇物质、胆烷酸、内源性大麻素等物质有利于肝纤维化的治疗，但还存在耐药性强、效果不显著等缺陷，因此，迫切需要开发新药来治疗肝纤维化[7]。越来越多的文献报道植物提取物在抗纤维化方面发挥着积极作用[8,9]。

各种肝病中常常会出现肝脏组织病变，据报道许多植物提取物具有改善肝脏组织病变的功效。有数据显示香茅草提取物可改善H2O2诱导的大鼠肝脏组织充血、浸润、细胞质空泡化和肝细胞变性等病变[10]。有研究表明没食子酸、黄连素和波棱瓜提取物均可减轻CCl4诱导的小鼠肝脏组织脂肪变性，胞质空泡化及肝细胞坏死等病变现象[11-13]。另外，大蒜素可减轻CCl4诱导的大鼠肝脏组织病变[14]。本研究结果显示，香叶木素可改善CCl4诱导的肝损伤大鼠肝脏组织细胞排列不规则、充血、细胞质空泡化、肝细胞坏死等病理变化。

肝细胞凋亡的增加是肝纤维化进程中的常见症状[15]。大量文献报道植物提取物可调控细胞凋亡。有研究表明没食子酸具有减弱CCl4诱导的肝损伤大鼠肝脏组织细胞凋亡的功能[16]。有数据显示香叶木素可抑制缺血再灌注诱导的急性肾损伤小鼠肾脏细胞凋亡的上升[17]。在阿霉素诱导的视网膜损伤大鼠中，香叶木素可减弱视网膜组织细胞凋亡的增强[18]。Yang等[19]发现香叶木素还可降低内毒素诱导的急性肝衰竭小鼠肝脏组织细胞凋亡的增加。本文结果显示，香叶木素可增强CCl4诱导的肝损伤大鼠肝脏组织Ki67表达，降低细胞凋亡。

越来越多的研究表明多种植物提取物具有缓解肝纤维化的作用。据报道在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中，桑叶提取物可降低肝纤维化[20]。有研究发现食用辣椒素可抑制胆管结扎或CCl4诱导的小鼠肝纤维化[21]。有数据显示满天星异荭草苷和虾仔花提取物都具有减轻CCl4诱导的大鼠肝纤维化的功效[22，23]。本研究结果显示，香叶木素可缓解CCl4诱导的肝损伤大鼠肝纤维化。

NLRP3炎性小体在各类疾病中具有重要作用，NLRP3炎性小体的活化会导致肝纤维化的加剧[24-26]。研究表明许多植物提取物可调节NLRP3炎性小体活性。Wang等[27]发现在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎小鼠中，槐耳提取物可降低NLRP3炎性小体活性发挥保护作用。有数据显示菊苣提取物可通过抑制NLRP3炎性小体活性起到抗糖尿病的功效[28]。据报道野风仙花提取物可抑制脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠NLRP3表达的上升，降低NLRP3炎性小体活性[29]。另外，香叶木素也可抑制脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠NLRP3和ASC表达的升高，抑制NLRP3炎性小体活性[30]。本文结果显示，香叶木素可减弱CCl4诱导的肝损伤大鼠NLRP3炎性小体信号通路活化。

综上所述，在CCl4诱导的肝损伤大鼠中，香叶木素可减轻肝脏组织病变，增强细胞增殖，降低细胞凋亡，改善肝纤维化，减弱NLRP3炎性小体相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase 1和IL-1β表达。香叶木素可通过抑制NLRP3炎性小体信号通路缓解CCl4诱导的肝损伤大鼠肝纤维化。下一步将计划研究香叶木素对其他因素导致的肝纤维化的影响。