iNKT细胞对哮喘小鼠肺树突状细胞表面分子和促炎性细胞因子表达水平的影响①

陈千慧 郭旭雪 邓霓姗 陈硕 何青 杨巧玉 王爱玲 丁续红 余红缨 聂汉祥

(武汉大学人民医院呼吸内科，武汉 430060)

恒定自然杀伤T细胞(invariant natural killer T cells,iNKT cells)是一类独特的淋巴细胞亚群，通过分泌Th1和Th2细胞因子如IFN-γ和IL-4等，发挥免疫调节作用，并由此作为连接固有免疫和获得性免疫的桥梁[1,2]。本课题组的初步研究显示iNKT细胞可以增强哮喘小鼠的过敏性气道炎症反应[3]，但机制尚不清楚。目前认为树突状细胞(Dendritic cells,DCs)可以诱导原始CD4+T细胞分化为Th2细胞，启动和维持哮喘Th2反应[4]。因此，本研究首先观察过继转移iNKT细胞对哮喘小鼠肺树突状细胞(Lung dendritic cells,LDCs)表面分子和分泌细胞因子水平的影响；进一步以卵清白蛋白(OVA)致敏和激发CD1d-/--BALB/c小鼠(缺乏活化的iNKT细胞)，观察缺乏iNKT细胞对小鼠LDCs表面分子和分泌细胞因子水平的影响，探讨iNKT细胞与哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性细胞因子表达水平的关系。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 6周龄健康雌性野生型(Wild type,WT)BALB/c小鼠和CD1d-/--BALB/c小鼠分别购自武汉大学实验动物中心和美国Jackson实验室，无特定病原菌(Specific-Pathogen Free,SPF)环境饲养。

1.1.2主要试剂 鸡卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA,Grade,V)和氢氧化铝凝胶购于美国Sigma公司；IL-12p70、IL-6、TNF-α和 IL-10 ELISA试剂盒购于美国eBioscience公司；PE-Cy5标记的TCR-β、PE-Cy5标记的F4/80、PE-Cy5标记的同型阴性对照、APC-Cy7标记的CD11c、PE标记的MHCⅡ、PE标记的CD40、PE标记的CD80、PE标记的CD86、固定剂和破膜剂均购于美国eBioscience公司；CD11c磁珠分选试剂盒和iNKT细胞磁珠分选试剂盒购于美国Miltenyi Biotec公司；Ⅰ型胶原酶购自Invitrogen公司；PE标记的未负载的小鼠CD1d四聚体和PBS-57/小鼠CD1d四聚体由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)赠送。

1.2方法

1.2.1小鼠分组和哮喘模型的建立 24只WT-BALB/c小鼠按数字表法随机分为正常对照组、哮喘组和过继转移组，每组8只；12只CD1d-/--BALB/c小鼠按随机数字表法分为CD1d-/-对照组和CD1d-/-哮喘组，每组6只。建立小鼠哮喘模型的方法：哮喘组、过继转移组和CD1d-/-哮喘组小鼠于第0天和第7天腹腔注射含100 μg OVA和20 μg氢氧化铝凝胶的PBS 200 μl致敏，随后于第25、26和27天以1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，使用含100 μg OVA的PBS 50 μl鼻腔滴入激发。正常对照组和CD1d-/-对照组小鼠在相应时间内腹腔注射等量的PBS并以PBS鼻腔滴入。

1.2.2小鼠iNKT细胞的制备及过继转移 取末次激发24 h后的哮喘小鼠的脾脏制备成脾单个核细胞悬液，采用磁珠分选法分选iNKT细胞(纯度95%左右)，按试剂说明书操作。于第25天OVA激发前1 h，将iNKT细胞经尾静脉注射到过继转移组小鼠体内，每只注入1×106个细胞。

1.2.3LDCs数量和表面分子表达水平的检测 LDCs表面表达CD11c分子，不表达F4/80分子，因此以CD11c+F4/80-细胞标记LDCs[5]。为了检测LDCs数量和表面分子表达水平，取各组小鼠右肺组织，充分切碎后Ⅰ型胶原酶消化，使用50 μm细胞滤网过滤获得肺单细胞混悬液，以密度梯度离心法分离肺单细胞混悬液中单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs)，调整细胞数为(5～10)×109L-1。取 100 μl于离心管中，加入抗小鼠 CD16/CD32抗体，避光，4℃，30 min；随后加入PE-Cy5标记的F4/80和APC-Cy7标记的CD11c，于对照管中分别加入PE-Cy5和APC-Cy7标记的IgG1作为阴性对照，避光，4℃，50 min，PBS 液洗涤细胞1次后重悬细胞至0.5 ml PBS中，上机检测，以CD11c+F4/80-细胞占MNCs的百分比表示LDCs数量。为了检测LDCs表面分子的表达水平，取肺MNCs混悬液100 μl，首先加入PE-Cy5标记的F4/80和APC-Cy7标记的CD11c，避光，4℃，30 min；再分别加入PE标记的MHCⅡ、CD40、CD80和CD86，对照管加入PE标记的IgG1作为阴性对照，避光，4℃，30 min；PBS 液洗涤细胞1次后使用0.5 ml PBS重悬细胞，上机检测，以MHCⅡ+、CD40+、CD80+和CD86+CD11c+F4/80-细胞占CD11c+F4/80-细胞(LDCs)的百分比表示LDCs表面分子的表达水平。

1.2.4LDCs的分离和培养 取末次激发24 h小鼠的左肺，制备肺MNCs混悬液，首先采用磁珠分选法分选肺MNCs混悬液中的CD11c+细胞；随后使用流式细胞仪(Epics AltraⅡ)分选CD11c+F4/80-细胞，即为LDCs(纯度 > 99%)。用含有10%热灭活胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需基酸、50 μmol/L巯基乙醇、25 μg/ml庆大霉素和50 U/ml 青霉素的RPMI1640完全培养基重悬细胞于96孔板中，每孔LDCs 2×105个，在存在或不存在OVA(100 μg/ml)条件下体外培养72 h，收集培养上清液，-80℃保存，用于检测细胞因子水平。

1.2.5LDCs培养上清液中细胞因子水平的检测 采用ELISA法检测LDCs培养上清液中IL-12p70、IL-6、TNF-α和 IL-10水平，参考试剂说明书进行检测。

2 结果

2.1过继转移iNKT细胞对哮喘小鼠LDCs数量、表面分子和分泌细胞因子水平的影响

2.1.1过继转移组与哮喘组、正常对照组小鼠LDCs数量的比较 过继转移组与哮喘组、正常对照组小鼠LDCs数量分别为(34.8±1.61)%、(28.2±3.91)%和(19.1±4.36)%，结果显示过继转移组小鼠LDCs的数量与哮喘组、正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 3组小鼠LDCs占肺MNCs的百分比比较Fig.1 Comparison of percentages of lung dendritic cells(LDCs)in lung mononuclear cells(MNCs)in three groups

2.1.2过继转移组与哮喘组、正常对照组小鼠LDCs表面分子表达水平的比较 以MHCⅡ+、CD40+、CD80+和CD86+CD11c+F4/80-细胞占CD11c+F4/80-细胞(LDCs)的百分比表示LDCs表面分子的表达水平，结果显示过继转移组小鼠LDCs表面分子MHCⅡ、CD40、CD80、CD86表达水平与哮喘组、正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图2、表1。

2.1.3过继转移组与哮喘组、正常对照组小鼠LDCs分泌细胞因子水平的比较 过继转移组小鼠LDCs培养上清液中IL-12p70、IL-6和TNF-α水平明显高于哮喘组(P<0.05或P<0.01)，但IL-10水平低于哮喘组(P<0.05或P<0.01)；正常对照组小鼠LDCs培养上清液中IL-12p70、 IL-6、 TNF-α和IL-10可忽略不计(表2)。

图2 3组小鼠LDCs表面分子MHCⅡ、CD40、CD86和CD80表达水平的比较Fig.2 Comparison of expression levels of MHCⅡ,CD40,CD86 and CD80 on LDCs in three groups

表1 3组小鼠LDCs表面分子MHCⅡ、CD40、CD86、CD80表达水平的比较Tab.1 Comparison of expression levels of MHCⅡ,CD40,CD86 and CD80 on LDCs in three

2.2缺乏iNKT细胞对哮喘小鼠LDCs数量、表面分子和分泌细胞因子水平的影响

2.2.1CD1d-/-哮喘组与哮喘组、正常对照组、CD1d-/-对照组小鼠LDCs数量的比较 CD1d-/-哮喘组、哮喘组、正常对照组和CD1d-/-对照组小鼠LDCs数量分别为(22.3±4.32)%、(28.0±3.56)%、(19.1±4.36)%和(17.0±3.78)%，结果显示CD1d-/-哮喘组小鼠LDCs数量明显低于哮喘组(P<0.05)，但明显高于CD1d-/-对照组(均P<0.05)，且CD1d-/-对照组小鼠LDCs数量与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

2.2.2CD1d-/-哮喘组与哮喘组、正常对照组、CD1d-/-对照组小鼠LDCs表面分子表达的比较CD1d-/-哮喘组小鼠LDCs MHCⅡ、CD40、CD80、CD86的表达水平明显低于哮喘组(P<0.05或P<0.01)，但哮喘组和CD1d-/-哮喘组小鼠LDCs的MHCⅡ、CD40、CD80、CD86表达水平明显高于正常对照组和CD1d-/-对照组(P<0.05或P<0.01)，但CD1d-/-对照组小鼠LDCs的MHCⅡ、CD40、CD80、CD86表达水平与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3、图4。

2.2.3CD1d-/-哮喘组与哮喘组、正常对照组、CD1d-/-对照组小鼠LDCs分泌促炎性细胞因子水平的比较 哮喘组小鼠LDCs培养上清液中IL-12p70、IL-6和TNF-α水平明显高于CD1d-/-哮喘组(P<0.05或P<0.01)，但IL-10水平低于CD1d-/-哮喘组(P<0.05)；正常对照组和CD1d-/-对照组小鼠LDCs培养上清液中IL-12p70、IL-6、TNF-α和IL-10可忽略不计(表4)。

图3 各组小鼠LDCs占肺MNCs的百分比比较Fig.3 Comparison of percentages of LDCs in lung MNCs in each group

图4 各组小鼠LDCs表面分子MHCⅡ、CD40、CD86和CD80表达水平的比较Fig.4 Comparison of expression levels of MHCⅡ,CD40,CD86 and CD80 on LDCs in each group

表2 3组小鼠LDCs体外培养上清液中IL-12p70、IL-6、TNF-α和IL-10水平的比较Tab.2 Comparison of levels of IL-12p70,IL-6,TNF-α and IL-10 in culture supernatant of LDCs in three /ml)

表3 各组小鼠LDCs表面分子MHCⅡ、CD40、CD86和CD80表达水平的比较(n=6或Tab.3 Comparison of expression levels of MHCⅡ,CD40,CD86 and CD80 on LDCs in each group(n=6 or

表4 各组小鼠LDCs体外培养上清液中IL-12p70、IL-6、TNF-α和IL-10水平的比较(n=6或Tab.4 Comparison of levels of IL-12p70,IL-6,TNF-α and IL-10 in culture supernatant of LDCs in each group(n=6 or

Note：1)P<0.05,compared with CD1d-/-asthma group;2)P<0.01,compared with CD1d-/-asthma group.

3 讨论

iNKT细胞是非经典主要组织相容性复合体Ⅰ类分子CD1d限制性的、能够识别糖脂类抗原的一群特殊的天然T细胞亚群[6,7]。iNKT细胞可以通过识别来源于病原微生物的外源性脂类抗原或内源性脂类抗原活化[1，2]。随着iNKT细胞活化，可以快速分泌大量细胞因子，如IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IL-17、IL-21、IL-22、TNF和GM-CSF等，参与调节获得性免疫反应[8]。研究显示iNKT细胞可以增强OVA诱导的哮喘小鼠过敏性气道炎症反应[3]，但机制尚不清楚。本研究发现iNKT细胞可以增强哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性细胞因子的表达水平，这可能与其增强哮喘小鼠气道炎症有关。

根据表面分子表达水平和分泌细胞因子类型与水平，DCs可以分为不成熟和成熟DCs两个阶段[9，10]。成熟DCs高表达表面分子，如CD80、CD86、CD40和MHCⅡ等，产生促炎性细胞因子，如IL-12、IL-6和TNF-α等，而免疫负相调节因子如IL-10分泌水平低；成熟DCs可以诱导原始T细胞增殖分化，因此，成熟DCs被认为是免疫原性DCs[10]。不成熟DCs表面分子表达水平低，不产生或产生少量促炎性细胞因子；不成熟DCs可以诱导T细胞无能，因此，不成熟DCs被认为是耐受原性DCs[10]。本研究发现，野生型小鼠LDCs表面分子表达水平低，低分泌促炎性细胞因子如IL-12、IL-6和TNF-α，提示野生型小鼠LDCs是不成熟DCs。哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性细胞因子表达水平明显增高，但IL-10分泌水平明显降低，提示哮喘小鼠LDCs是成熟DCs。为了探讨iNKT细胞对哮喘小鼠LDCs成熟程度的影响，我们首先观察iNKT细胞过继转移对哮喘小鼠LDCs表面分子和细胞因子表达水平的影响，结果发现过继转移组小鼠LDCs的MHCⅡ、CD40、CD80、CD86表达水平以及LDCs体外培养上清液IL-12p70、IL-6、TNF-α水平明显高于哮喘组，但IL-10分泌水平降低，提示过继转移iNKT细胞可以增加哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性细胞因子的表达水平。由于CD1d基因敲除小鼠缺乏iNKT细胞活化必要的MHCⅠ类限制性元素而缺乏功能性iNKT细胞[11]，我们进一步观察缺乏iNKT细胞对哮喘小鼠LDCs表面分子和细胞因子表达水平的影响。结果发现，CD1d-/-哮喘组小鼠LDCs 表面分子如MHCⅡ、CD40、CD80、CD86的表达水平以及分泌促炎性细胞因子水平低于哮喘组，但IL-10分泌水平高于哮喘组，结果提示缺乏iNKT细胞可以降低哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性细胞因子的表达水平。上述结果提示iNKT细胞可以增加哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性细胞因子的表达水平，促进LDCs免疫原性成熟。目前认为LDCs是诱导哮喘Th2反应的中心环节[4]，因此我们推测iNKT细胞增强OVA诱导的哮喘小鼠气道炎症可能与其增强LDCs的免疫原性成熟水平有关。

iNKT细胞促进LDCs免疫原性成熟的机制尚不清楚。目前认为DCs表达分子CD40与其配体CD40L(CD40 ligand)相互作用是诱导其成熟的机制之一[12]。本实验结果显示iNKT细胞可以增加哮喘小鼠LDCs表面CD40表达水平。研究显示，抗原激活的iNKT细胞表面CD40L分子表达水平增高[13]。因此，我们推测iNKT细胞可能通过CD40-CD40L途径促进LDCs成熟，但需进一步的研究。

综上所述，iNKT细胞可以增强哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性细胞因子的表达水平，促进LDCs免疫原性成熟。