99mTc-转铁蛋白-DTPA-Gd核素/磁性双模态分子影像探针基于转铁蛋白受体表达水平的肿瘤成像

顾丙新，孙玉云，杨忠毅，罗建民，张建平，章英剑

1.复旦大学附属肿瘤医院核医学科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；2.复旦大学生物医学影像研究中心，上海 200032；3.上海分子影像探针工程技术研究中心，上海 200032

转铁蛋白（Holo-Transferrin，Tf）受体（transferrin receptor，TfR）是一种广泛存在于细胞膜表面的糖蛋白，在介导铁以及微量元素的运输与转运中起重要作用［1-2］。研究发现［3］，多种肿瘤细胞高表达TfR，并已被开发为抗肿瘤药物递送的靶点。然而，靶向治疗的效果在很大程度上依赖于肿瘤细胞的TfR表达情况。目前，临床及科研检测TfR最常用的方法为免疫组织化学分析，但该种检测方法为离体测定、有创伤性，且在多病灶的情况下作用较为局限。分子影像［4］能够反映活体状态下生物进程中分子水平的变化，为在体、无创性检测TfR提供了契机。本课题组前期合成了99mTc-Tf-DTPA-Gd核素/磁性双模态分子影像探针，并探讨了在鼠源性三阴性乳腺癌诊断中的应用［5］，现讨论该探针用于检测多种人源性肿瘤TfR表达情况的可行性。

1 材料和方法

1.1 主要材料与仪器

Tf购自美国Sigma-Aldrich公司，氯化钆（GdCl3）及氯化亚锡购自上海百灵威化学技术有限公司，Na99mTcO4购自上海欣科医药有限公司，抗人TfR抗体购自美国Abcam公司，小动物磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）仪器（型号BioSpec 7.0T/20）购自德国Bruker公司，小动物单光子发射计算机断层摄影术（singlephoton emission computed tomography，SPECT）/计算机断层摄影术（computed tomography，CT）仪器（型号Nano SPECT/CT PLUS）购自美国Bioscan公司。

1.2 99mTc-Tf-DTPA-Gd的制备与表征

双模态探针99mTc-Tf-DTPA-Gd的制备过程及表征参照本课题组前期研究［5］。以下为探针合成技术路线的简述：在5 mL离心管中，将54 mg DTPAa粉末缓慢加入30 mg 转铁蛋白（15 mg/mL，溶于0.1 mol/L碳酸氢盐缓冲液，pH=9.0），室温下持续搅拌10 h后超滤离心（截留相对分子质量为10×103，8 000 rpm，15 min）提纯Tf-DTPA；将4 mg GdCl3加入Tf-DTPA（15 mg/mL，溶于0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液，p H 为6.5），室温下持续搅拌10 h后超滤离心提纯Tf-DTPA-Gd。在1.5 mL离心管中，加入0.5 mg Tf-DTPA-Gd（1 mg/mL，溶于水），74 MBq Na99mTcO4和2 μL SnCl2溶液（1 mg/mL，溶于0.1 mol/L HCl）室温下震荡反应30 min。

1.3 裸小鼠移植瘤模型的建立

所有动物实验均获复旦大学动物伦理委员会批准。ACHN（人肾癌细胞）、GBC-SD（人胆囊癌细胞）、HCT-8（人肠癌细胞）、MDAMB-468（人乳腺癌细胞）、SGC-7901（人胃癌细胞）、SMMC-7721（人肝癌细胞）、SW1990（人胰腺癌细胞）、Tca-8113（人舌癌细胞）和U87（人胶质瘤细胞）经传代培养后，取处于对数生长期的细胞100 μL（约1×106个细胞），分别接种于每只BALB/c雌性裸小鼠右后肢；PC-3（人雄激素非依赖性前列腺癌细胞）接种于每只BALB/c雄性裸小鼠右后肢；3～6周后待肿瘤长至0.8～1.0 cm时进行显像。

1.4 小动物SPECT/CT显像及小动物MRI显像

1.4.1 小动物SPECT/CT显像

取各模型荷瘤小鼠各3只，经尾静脉注射200 μL含600 μCi（22.2 MBq）99mTc-Tf-DTPAGd，4 h后用2.5%异氟烷麻醉，行SPECT/CT显像。通过Bioscan自带InVivoScope软件重建图像，并计算肿瘤与肌肉组织的靶本比即靶区/肌肉组织（target-to-muscle ratios，T/M）。

1.4.2 小动物MRI显像

取MDA-MB-468和PC-3荷瘤小鼠各3只，经尾静脉注射0.05 mmol Gd/kg Tf-DTPA-Gd，于注射前和注射后4 h，用2.5%异氟烷麻醉后行MRI显像。线圈及扫描参数：选用40 mm内径小鼠全身容积线圈；采用T1-MSME序列对荷瘤鼠进行冠状位采集，扫描参数设置如下：重复时间（time of repetition，TR）=400 ms，回波时间（time of echo，TE）=8.0 ms，层厚=1.0 mm，视野（field of vision，FOV）=35 mm×25 mm，矩阵（Matrix）=256×256。通过Bruker自带ParaVison 6.0工作站重建并分析图像数据，在肿瘤部位勾画感兴趣区（region of interest，ROI），测量肿瘤部位的T1信号强度（signal intensity，SI）值，并通过公式计算注射后肿瘤部位相对信号增强（relative signal enhancement，rSE）：rSE（%）=SIpost/SI0×100%

其中，SIpost为注射探针之后肿瘤部位的信号强度值，SI0为注射探针前肿瘤部位的信号强度值。

1.5 H-E染色与免疫组织化学分析

显像结束后，拉颈处死荷瘤鼠摘取肿瘤组织，经质量分数4%的多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片，行H-E染色和TfR免疫组织化学检测。采用H-score法［6］进行半定量：根据染色阳性细胞的比例和染色强度，阳性细胞比例＜33%为（-）；33%≤阳性细胞比例＜66%或阳性细胞比例为100%但染色强度低等为（+）；66%≤阳性细胞比例或阳性细胞比例为100%但染色强度中等为（++）；阳性细胞比例为100%且染色强度高等为（+++）。每个切片由两位高年资病理科医师独立打分，且每个样品重复3次取平均值。

1.6 统计学处理

采用IBM SPSS 20.0软件进行统计分析，符合正态分布的数据以x±s表示。采用两样本t检验及Spearman分析数据，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 99mTc-Tf-DTPA-Gd 的表征

99mTc-Tf-DTPA-Gd每分子转铁蛋白偶联26个钆原子（Gd），标记率及放化纯均大于96%，并在50%的胎牛血清中有较好的稳定性，8 h的标记率仍大于90%，可用于体内成像实验。

2.2 小动物SPECT/CT显像

经尾静脉注射探针99mTc-Tf-DTPA-Gd后4 h，ACHN、GBC-SD、HCT-8、MDA-MB-468、SGC-7901、SMMC-7721、SW1990、Tca-8113和U87肿瘤可清晰显影（图1A），其中MDAMB-468、SMMC-7721和U87肿瘤具有较高的T/M值（图1B），ACHN、GBC-SD、HCT-8、SGC-7901、SW1990和Tca-8113肿瘤T/M值相对较低；而PC-3肿瘤几乎无放射性摄取，接近肌肉本底，T/M值与MDA-MB-468相比差异有统计学意义（t=6.919，P=0.002）。显像示肝脏、肠道有很高的放射性摄取，表明探针主要经消化系统排泄；同时肾和膀胱也有较高的放射性摄取，提示少部分探针经泌尿系统排泄。

2.3 小动物MRI显像

注射探针前，MDA-MB-468与PC-3移植瘤组织的信号强度与周围肌肉组织一致。经尾静脉注射探针Tf-DTPA-Gd后4 h，MDA-MB-468肿瘤轮廓清晰显示，肿瘤组织强化明显，与周围几乎无强化的肌肉组织形成“亮”的阳性对比（图2A）；但PC-3移植瘤信号强度仍与周围肌肉组织一致，并无肉眼可辨别的明显强化，其供血血管可清晰显示（图2A）。MDA-MB-468移植瘤组织较注射探针前T1信号相对增强达（154.88±8.71）%，而PC-3肿瘤为（111.31±3.46）%，两者差异有统计学意义（t=8.441，P=0.001，图2B）。

图1 10种移植瘤模型的SPECT/CT显像及T/M值Fig.1 Small-animal SPECT/CT imaging and the value of T/M in 10 kinds of xenograft tumor models

图2 MDA-MB-468与PC-3移植瘤模型的MRI显像、信号强度的对比以及免疫组织化学染色Fig.2 MRI quantitative analysis and immunohistochemical staining in MDA-MB-468 and PC-3 tumor models

2.4 免疫组织化学染色与H-E染色

免疫组织化学染色可清晰定位TfR的位置（图2A）。10种移植瘤模型中，除PC-3表达阴性，其余10种均不同程度表达TfR（图3），并且在MDA-MB-468、SGC-7901、SMMC-7721和U87移植瘤表达较高。进一步分析我们发现，TfR的免疫组织化学检测结果与探针的T/M值呈明显的正相关（相关系数为r=0.915，P＜0.001）。探针在细胞及体内的毒性实验已在前期研究中完成，此处，我们再次评估探针对10种移植瘤组织是否会有刺激或损伤作用。H-E染色结果显示，注射探针后肿瘤组织并无变性、水肿、炎性浸润及坏死等表现，表明探针对肿瘤组织没有明显影响（图4）。

图3 10种移植瘤组织表达TfR的半定量分析Fig.3 The semi-quantitative analysis of TfR in different xenograft tumor models

图4 10种移植瘤组织的H-E染色Fig.4 H-E staining of 10 xenograft tumors

3 讨 论

目前，基于TfR的在体成像研究涉及到荧光［7］、MRI［8］及核素［9］等。然而，任何单一模态成像都有一定的局限性［10］，如核素的高灵敏度、低分辨率，MRI的高分辨率、低灵敏度。有鉴于此，将两种或多种成像技术优势融合的多模态成像应运而生［11］。99mTc的半衰期适中（6 h）、能量单一（141 keV γ射线）、标记条件温和，是临床理想的核素；Gd能够缩短组织弛豫时间，提供阳性对比，是目前临床最常用的MRI对比剂。因此，本研究探讨99mTc标记、Gd螯合的转铁蛋白用于检测10种移植瘤表达TfR情况的可能性。

有研究［12］报道，TfR的表达水平与肿瘤的恶性程度相关。然而，不同肿瘤的恶性程度没有明确界定，且不同研究中同一肿瘤表达TfR也有出入［13-14］。本研究中，10种不同组织来源的移植瘤模型中，有9种移植瘤不同程度地摄取99mTc-Tf-DTPA-Gd，免疫组织化学检测结果显示，9种移植瘤均表达TfR；而PC-3移植瘤不摄取探针，且免疫组织化学检测结果也显示该肿瘤几乎不表达TfR，与成像结果一致；同时相关分析结果显示，免疫组织化学检测与探针的T/M值呈明显的正相关，表明99mTc-Tf-DTPA-Gd成像能够反映肿瘤TfR表达的情况。在前期研究中［5］，Tf-DTPA-Gd能够特异性结合TfR，且肿瘤部位强化时间达24 h以上。本研究中，MRI结果也提示高表达TfR的MDA-MB-468移植瘤摄取Tf-DTPA-Gd较不表达TfR的PC-3模型差异有统计学意义，表明Tf-DTPA-Gd MRI也能够反映肿瘤TfR表达情况。在SPECT成像中，我们可以精确地定位肿瘤的位置，但肿瘤结构、与周边组织的联系、供血血管等信息无法判断。MRI则可以清晰地显示肿瘤结构分层、有无坏死、对周边正常组织的侵袭情况，同时还能明确地分辨出肿瘤的供血血管。因此，核素、磁性双模态成像的融合对提高肿瘤诊断的准确性、治疗方案的选择、疗效评估、复发监测以及转移灶的寻找都具有重要的临床意义。

转铁蛋白能够穿透血脑屏障，对颅内恶性肿瘤的诊断有一定的优势［14-15］。本研究中，U87肿瘤高表达TfR，对探针99mTc-Tf-DTPA-Gd也有较高的摄取。同时，MRI具有超高的软组织分辨率，且能多平面、多功能序列成像，是目前诊断脑肿瘤的首选成像方式。因此，99mTc-Tf-DTPAGd是一种理想的检测脑肿瘤的双模态探针。

由于核素成像时注射探针的物质的量在纳摩尔（nmol）水平即可［16］，而MRI检查时需达到毫摩尔（mmol）水平，因此本课题组在SPECT成像实验中使用的是核素、磁性双模态探针99mTc-Tf-DTPA-Gd，而MRI检测中则使用的是磁性单模态探针Tf-DTPA-Gd。为达到一次注射即可得到两种模态对比，本课题组将进一步优化探针，如提高钆的偶联率或螯合其他弛豫率较高的元素。