肝豆灵片对硫酸铜模拟铜负荷诱导TX小鼠原代肝细胞凋亡的影响

陈永华， 杨文明， 江海林， 唐露露

（1.安徽中医药大学第一附属医院脑病中心，安徽合肥230031；2.安徽中医药大学研究生院，安徽合肥230038）

Wilson病是因遗传性ATP7B基因突变导致的铜代谢障碍性疾病［1］，铜蓄积中毒是其肝细胞损害的主要原因，内质网应激凋亡信号通路是重要肝细胞凋亡途径［2-3］，对此通路的干预可能是患者肝损害新的治疗靶点。中医证候学调查研究显示，铜邪毒与痰瘀血互结是Wilson病患者常见证候［4］，清热解毒、祛瘀通腑方肝豆灵片可改善肝损害，减少铜负荷诱导的肝细胞凋亡［5］，但其确切作用机制尚不明确，故本实验探讨该制剂治疗肝损害的分子机制。

1 材料

1.1 动物 2对Wilson病模型小鼠 （TX小鼠）及DL小鼠的种鼠均购于美国Jackson实验室，小鼠肝细胞用原代方法进行培养及分离得到［6］。SD大鼠44只，体质量 （195±15）g，购于安徽省实验动物中心，许可证号SYXK-2017-004，适应性饲养7 d后进行实验。

1.2 试药 肝豆灵片 （安徽省中医院制剂中心，0.3 g／片，批号20160012），由川黄连、紫丹参、血风藤、蜀大黄、蓬莪术、毛姜黄等组成，制备方法为用65%乙醇提取各药材有效成分，合并滤液，合适温度下烘制成干膏，加入炼蜜及淀粉，最后压片包装。硫酸铜 （国药集团化学试剂有限公司）；达尔白克必需基本培养基 （DMEM）购自美国Gibco公司，批号12400035；胎牛血清 （FBS）购自美国Hyclone公司，批号10099-156；HumanPERK、CHOP引物［宝生物工程 （大连）有限公司］；Salubrinal（特异性eIF2a磷酸化抑制剂，美国西格玛公司）。

1.3 仪器 二氧化碳培养箱 （上海基汇生物科技有限公司）；高性能超净工作台 （广东坤灵净化设备有限公司）；BG-Power300基本电泳仪电源 （北京百晶生物技术有限公司）；Gstorm梯度多重控温梯度PCR仪 （武汉成名仪器有限公司）；Amnis高速成像流式细胞仪 ［德国默克密理博（中国）有限公司］；分光光度计 ［北京北分瑞利分析仪器（集团）有限责任公司］。

2 方法

2.1 药物血清、硫酸铜培养基制备 SD大鼠随机分为空白组及肝豆灵片低、中、高剂量组，每组11只。参照韩辉等［7］报道方法，将肝豆灵片溶于5 mL灭菌用水中，配制成0.06、0.12、0.24 g／mL溶液，根据成人常规用药量标准换算成大鼠用药量 （1.20 g／kg），设置肝豆灵片低、中、高剂量组分别为0.60、1.20、2.40 g／kg，每天早晚2次灌胃给药，连续4 d。第4天给药结束后抽取1 h腹主动脉血，分离得到相应剂量含药血清，连同空白血清置于－20℃冰箱中保存。

前期预实验显示，在基础培养基中添加300 μmo1／L硫酸铜铜离子模拟的铜负荷继续培养TX小鼠原代肝细胞24 h时，原代肝细胞产生明显细胞毒性，其凋亡明显增加［2］；继续培养24 h时，不产生明显细胞凋亡作用。TX小鼠原代肝细胞由于ATP7B基因突变，导致铜转运出细胞外发生障碍，引起过量铜在肝细胞内蓄积，从而引起肝细胞毒性作用；DL小鼠原代肝细胞由于正常ATP7B基因编码表达正常肝细胞ATP7B蛋白酶，可正常转运肝细胞内的铜，并不会出现过量铜蓄积导致细胞中毒作用及凋亡［2］，故用300 μmol／L硫酸铜铜离子模拟原代肝细胞铜负荷进行实验，其配制方法为0.2495 gCuSO4·5H2O溶于10 mL DMEM中，得到含铜离子100 mmo1／L的母液， 稀释至300 μmo1／L后再加入 DMEM 培养基［7-8］。

2.2 肝细胞培养 采用两步灌注法分离和取TX、DL小鼠肝细胞，DMEM培养基进行培养，在37.1℃、6%CO2、相对饱和空气湿度条件下进行细胞培养，肝细胞呈贴壁生长，3.5 h后更换培养基。

2.3 分组及给药 设置有正常组、对照组、Salubrinal组及肝豆灵片低、中、高剂量组，其中正常组为DL小鼠分离的原代肝细胞，在用含10%血清培养基培养的基础上加用硫酸铜模拟的铜负荷；对照组为TX小鼠分离的原代肝细胞，在用含10%血清培养基培养的基础上加用硫酸铜模拟的铜负荷；肝豆灵片组为TX小鼠分离的原代肝细胞，在用含10%血清培养基培养的基础上加用硫酸铜模拟的铜负荷，加入通过原子吸收法检测的低、中、高剂量肝豆灵含药血清；Salubrinal组为TX小鼠分离的原代肝细胞，在用含10%血清培养基培养的基础上加用硫酸铜模拟的铜负荷，然后加入Salubrinal继续培养，6组培养原代肝细胞24 h。

2.4 肝细胞凋亡检测 取指数生长期的DL、TX小鼠原代肝细胞，按 “2.3”项下方法分组，通过流式细胞仪检测肝细胞凋亡。

2.5 PERK、p-eIF2a蛋白表达检测 取指数生长期的DL、TX小鼠原代肝细胞，按 “2.3”项下方法分组，通过Western Blot法检测肝细胞PERK、p-eIF2a蛋白表达，然后进行灰度值比对。

2.6 CHOP mRNA水平检测 取指数生长期的DL、TX小鼠原代肝细胞，按 “2.3”项下方法分组，通过RT-PCR法检测肝细胞CHOP mRNA水平。

2.7 统计学分析 通过SPSS 21.0软件进行处理，数据以（±s） 表示，组间资料比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 肝豆灵片对原代肝细胞凋亡的影响 图1显示，与正常组比较，对照组原代肝细胞凋亡率显著增加 （P＜0.01），而肝豆灵片组呈剂量依赖性地显著抑制其凋亡 （P＜0.05，P＜0.01）。

3.2 肝豆灵片对PERK蛋白表达的影响 图2显示，与正常组比较，对照组PERK蛋白表达 （P＜0.01）显著增加，而肝豆灵片组呈剂量依赖性地显著抑制其蛋白表达 （P＜0.05， P＜0.01）。

3.3 肝豆灵片对p-eIF2a蛋白表达的影响 图3显示，与正常组比较，对照组 p-eIF2a蛋白表达显著增加 （P＜0.01），而肝豆灵片组呈剂量依赖性地显著抑制其蛋白表达 （P＜0.05， P＜0.01）。

图1 肝豆灵片对原代肝细胞凋亡的影响 （n＝3）

图2 肝豆灵片对PERK蛋白表达的影响 （n＝3）

图3 肝豆灵片对p-eIF2a蛋白表达的影响 （n＝3）

3.4 肝豆灵片对CHOP mRNA水平的影响 图4显示，与正常组比较，对照组 CHOP mRNA水平显著增加 （P＜0.01），而肝豆灵片组呈剂量依赖性地显著降低其mRNA水平 （P＜0.05， P＜0.01）。

图4 肝豆灵片对CHOP mRNA水平的影响 （n＝3）

4 讨论

Wilson病在我国也称为肝豆状核变性，是少见的可治疗的常染色体隐性遗传性铜代谢障碍性疾病，其最常见临床特点之一是肝损害，铜在肝脏中的过量蓄积是最主要原因，但其引起肝细胞凋亡的确切分子病理机制尚不明确［9］。近年研究显示，内质网应激是铜沉积引起肝损害的新的潜在机制之一，Wilson病发生过程存在内质网应激，并且肝细胞功能恢复与内质网应激缓解也密切相关的［2］。长期铜过量蓄积在肝细胞可引起肝细胞内过度内质网应激，从而诱发和激活内质网应激反应的凋亡途径，损伤肝细胞功能，最终则引起其凋亡［2］。当机体长期处于高铜环境的情况下时，会引起细胞内氧化应激反应、脂质代谢异常、钙离子超载等细胞内环境紊乱，均会引起过度内质网应激，会触发细胞内未折叠蛋白质反应 （UPR）［10］。

UPR可通过解除GRP78与3种内质网跨膜蛋白的结合，从而启动下游信号通路，PERK蛋白是三者之一，受到内质网应激而激活分离出的PERK蛋白又能诱导CHOP蛋白表达，它为细胞凋亡途径的重要标志性蛋白，随后内质网应激持续过度存在将继续激活半胱天冬酶级联反应，最终引起肝细胞凋亡［11-13］。前期预实验显示，原代肝细胞PERK／eIF2α凋亡信号通路是肝细胞内质网应激凋亡途径中最主要的，故本实验选择内质网应激中该凋亡信号通路作为研究对象，发现硫酸铜模拟的铜负荷可引起肝细胞内质网应激，最终导致肝细胞凋亡，而肝豆灵片可抑制上述现象，并且可显著抑制TX小鼠原代肝细胞凋亡及PERK、p-eIF2a蛋白表达，显著降低CHOP mRNA水平，这些分子均为PERK／eIF2α／CHOP凋亡信号通路的关键信号物质。

中医认为［14］，Wilson病的外在病因为铜中毒，其主要内在病因为先天禀赋不足，机体阴阳平衡失调，脏腑功能紊乱，从而导致肝气不能正常疏泄，胆汁不能正常分泌，气运不能通达，最终导致铜毒邪内蕴不能正常向外排泄，蕴积体内化瘀化热，并且产生铜中毒，铜浊毒邪蓄积于人体各个脏腑、组织并产生相应症状，若毒邪经久不去，停滞于体内，则损伤脏腑及经络，积聚不能散除，经脉络脉闭塞，气运不畅，从而气机阻滞，痰随气阻，血行不畅，痰浊与瘀血相结，故该病的主要病理机制为铜毒邪内蕴体内，痰浊瘀血阻滞经脉。安徽中医药大学第一附属医院院内制剂肝豆灵片具有清热解毒、化瘀通腑的作用［14］，由川黄连、紫丹参、血风藤、蜀大黄、蓬莪术、毛姜黄等药材组成，具有保护Wilson病模型TX小鼠肝细胞功能的作用［15］，其机制可能与上调肝细胞组织miRNA-122表达有关；对铜负荷大鼠肝细胞损伤具有较好的干预作用，其机制可能与下调 Bax表达、上调 Bcl-2表达有关［16］；对Wilson病模型铜负荷大鼠的肝细胞的损伤具有一定保护及修复作用，其机制可能与调节胆汁酸和氨基酸代谢、改善脂质代谢有关［17］；近年来还发现，它减轻铜负荷大鼠肝细胞的保护作用机理可能与下调肝细胞组织NF1cB和Caspase-3表达、抑制肝细胞凋亡相关［18］，与本实验结果基本一致。由此可认为，肝豆灵片改善Wilson病小鼠肝损害作用与其清热解毒、化瘀通腑、解毒排铜功效有关，分子生物学机制主要是通过干预内质网应激 PERK／eIF2α／CHOP凋亡信号通路来保护肝细胞。

然而，本实验未检测代表细胞凋亡外源性途径［19］、线粒体途径等相应关键信号通路标志物的表达［20］，无法明确在铜负荷诱导肝细胞凋亡过程中2种途径的作用，以及两者与内质网应激凋亡途径信号通路相关交叉作用，需作进一步实验研究。