去铁胺预处理联合七氟醚后处理对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

糖尿病是心血管疾病的重要危险因素，合并糖尿病的缺血性心脏病患者围术期发生心肌缺血再灌注(I/R)损伤的比例是非糖尿病缺血性心脏病患者的2～3倍[1]，有效降低围术期糖尿病患者I/R损伤极为重要。七氟醚是一种广泛应用于临床和基础实验的吸入麻醉剂。七氟醚后处理(SPostC)可以发挥与缺血预处理类似的心肌保护作用，并且对年轻和健康心肌发生的I/R损伤具有良好的保护效果[2-3]。在糖尿病状态下，SPostC的保护作用弱化[4]，但具体机制尚未明确。我们前期研究发现缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在SPostC减轻健康心肌 I/R 损伤中发挥重要作用[5]。在糖尿病状态下，HIF-1α受损[6-7]，HIF-1α可能是导致SPostC心肌保护作用弱化的关键。本文旨在观察去铁胺预处理联合SPostC对糖尿病大鼠心肌I/R损伤的影响，探讨通过激活糖尿病状态下受损的HIF-1α恢复SPostC的心肌保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 离体心脏模型的制备

常州卡文斯实验动物有限公司提供清洁级健康雄性糖尿病GK大鼠75只，体质量300～350 g，周龄为14～16周，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2016-0010。参照参考文献[5]建立Langendorff模型：大鼠腹腔注射250 U/kg肝素抗凝和40 mg/kg 1%戊巴比妥钠麻醉后，固定在鼠板。迅速开胸暴露心脏及心底部大血管，剪下心脏，保留合适长度的主动脉(3～4 mm)，立即放入预冷的4 ℃ K-H液(NaCl 118 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L、KH2PO31.2 mmol/L、NaHCO325 mmol/L、葡萄糖11 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L，pH值7.45)中使心腔的血液排空。用眼科镊夹住主动脉两侧，4号手术线将心脏固定于灌注针上，用95%O2、5%CO2预先平衡过的37 ℃ K-H液行主动脉逆行灌注，剪开肺动脉及左心耳，通过二尖瓣口将自制橡胶球囊沿左心耳插入左心室，并连接Powerlab/8SP生物功能实验压力传感器系统。维持60～70 mmHg的灌注压，调整气囊大小和位置，并将左室舒张末期压力(LVEDP)维持在0～10 mmHg。上述步骤应在2 min内完成。离体心脏平衡20 min后，如心率>250次/min，左室发展压(LVDP)>80 mmHg、室性早搏<2次/min，则提示建模成功。

1.2 实验分组

将75只糖尿病大鼠随机分为5组(n=15)。对照组心脏持续灌注K-H液180 min。缺血再灌注组(I/R组)心脏平衡20 min后，灌注4 ℃ Thomas心脏停搏液使心脏停跳，32 ℃下心脏停跳40 min后(无灌注K-H液)，复温至37 ℃后再灌注K-H液复跳120 min。SPostC组心脏平衡20 min后，灌注4 ℃ Thomas心脏停搏液使心脏停跳，32 ℃下缺血40 min后，再灌注2.4%七氟醚(日本丸石制药株式会社)饱和的K-H液15 min，后续灌正常K-H液105 min。去铁胺预处理组(DFO组)心脏缺血前24 h大鼠腹腔给予200 mg/kg去铁胺(瑞士诺华制药有限公司)，其余同I/R组。去铁胺预处理+SPostC组(DFO+SPostC组)心脏缺血前24 h大鼠腹腔给予200 mg/kg去铁胺，其余同SPostC组。

1.3 血流动力学指标检测

各组再灌注结束时，通过Powerlab/8SP数据采集系统记录心率、LVDP、LVEDP以及左室内压最大上升速率(+dp/dtmax)等指标。

1.4 透射电镜观察心肌超微结构

再灌注2 h后，从每组中随机取4个心脏，每个心脏取1 mm×1 mm×1 mm左室心肌，经过固定、冲洗、脱水、包埋、切片、染色后，H-600型透射电镜(×10 000，日本Hitachi公司)观察心肌细胞线粒体超微结构。

1.5 TTC染色法测定心肌梗死面积

再灌注2 h后，从每组中随机取5个心脏，置于-80℃冰箱中冷冻7 min，将整个心脏从心尖到心脏底部进行切片，切成厚度大致相同的5片。将心脏切片置于37 ℃、1% TTC溶液中染色20 min，10%福尔马林固定24 h后进行数码照相。心肌梗死面积采用Image-Pro Plus 6.0软件计算。

1.6 Western blot分析

再灌注2 h后，从每组中随机取6个心脏，通过组织裂解液提取心肌组织总蛋白。取蛋白样品30 μg，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，转膜，于37 ℃封闭2 h，分别加入小鼠抗大鼠HIF-1α单克隆抗体(1∶1 000，美国Sigma公司)、小鼠抗大鼠血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体(1∶1 000，美国Sigma公司)和山羊抗鼠GAPDH多克隆抗体(1∶1 000，美国Sigma公司)，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗兔抗鼠IgG-HRP和兔抗山羊IgG-HRP(美国Sigma公司)室温孵育1 h。ECL显色成像，应用Quantity One图像分析系统对目的蛋白条带进行灰度值分析。

1.7 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析，Newman-Keuls法进行显著性检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血流动力学指标比较

与对照组相比，I/R组、SPostC组、DFO组、DFO+SPostC组心率、LVDP、+dp/dtmax均明显降低，LVEDP明显增加(P均<0.05)；与I/R组相比，DFO组、DFO+SPostC组LVEDP明显降低，且心率、LVDP、+dp/dtmax明显改善(P均<0.05)；与DFO组相比，DFO+SPostC组LVEDP明显降低，且心率、LVDP、+dp/dtmax明显改善(P均<0.05)。见表1。

表1 各组血流动力学指标比较

2.2 心肌线粒体超微结构比较

电镜下观察，对照组线粒体结构完整，排列整齐；I/R组肌丝溶解甚至断裂，线粒体肿胀，嵴膜间隙变宽、破裂，肌浆网高度扩张；SPostC组线粒体与I/R组无明显区别；DFO组线粒体结构完整度略优于I/R组，但线粒体仍显肿胀，排列紊乱，肌丝部分溶解；DFO+SPostC组较DFO组明显改善，线粒体形态基本完整，排列整齐，但仍略有肿胀。见图1。

2.3 心肌梗死面积比较

与对照组相比，SPostC组梗死面积明显增加[(37.2±3.77)%对(2.84±0.93)%，P<0.05]。与I/R组[(38.8±2.28)%]相比，DFO组[(29.2±3.11)%]和DFO+SPostC组[(21.4±4.16)%]的梗死面积均明显减少(P均<0.05)；DFO+SPostC组与DFO组相比，心肌梗死面积明显减少(P<0.05)。见图2。

图2 TTC染色检测各组心肌梗死情况

2.4 HIF-1α、VEGF蛋白表达水平比较

与对照组相比，SPostC组HIF-1α、VEGF蛋白表达水平均明显增加(P均<0.05)；与I/R组相比，DFO组、DFO+SPostC组HIF-1α、VEGF蛋白表达水平均明显增加(P均<0.05)；DFO+SPostC组HIF-1α、VEGF蛋白表达水平与较DFO组明显增加(P<0.05)，见图3、表2。

图3 Western blot法检测各组HIF-1α、VEGF蛋白表达情况

表 2 各组HIF-1α、VEGF蛋白表达水平比较

3 讨论

本研究中，Langendofff体外灌注模型消除了体液和神经因素的影响，有助于观察药物对心脏的直接影响。本研究结果表明，遭受I/R损伤后，糖尿病大鼠心肌线粒体结构明显受损，提示离体心脏I/R损伤模型制备成功。SPostC组各指标与I/R组并无明显差异，这与Drenger的研究结论一致[4]，说明糖尿病心肌发生 I/R 损伤时的心肌保护作用被弱化。

研究表明，在低氧条件下，HIF-1α是通过调控VEGF、促红细胞生成素(EPO)等下游靶基因的表达促使细胞生存的关键因子[8]，也是触发心肌内源性保护机制的枢纽。我们前期研究发现，HIF-1α是介导SPostC对抗缺血心肌损伤的内源性关键靶点。为了证实在糖尿病状态下，这一靶点受损可能是导致SPostC保护作用弱化的根源，本研究观察去铁胺预处理联合SPostC对糖尿病大鼠心肌I/R损伤的影响，发现DFO组心功能明显改善，心肌超微结构明显优于I/R组，心肌梗死面积也明显减少，而DFO+SPostC组各指标优于DFO组，提示去铁胺具有减轻糖尿病大鼠心肌I/R损伤的作用，并且能够恢复糖尿病状态下SPostC的心肌保护作用。

去铁胺是美国食品和药品管理局(FDA)批准的一种高选择性铁螯合剂，临床使用已近半个世纪。去铁胺不仅能阻断芬顿反应，还能抑制脯氨酰羟化酶，从而激活某些缺氧诱导转录因子，使细胞适应缺氧的环境。研究表明，无论全身还是局部应用去铁胺都能稳定并激活HIF-1α，上调其下游靶基因，促进糖尿病患者伤口的愈合[9]。本研究结果表明，I/R组HIF-1α表达并没有增加，这与Marfella等[10]的研究结论一致，说明在糖尿病状态下HIF-1α受损，即使缺氧也不能有效激活HIF-1α，使其发挥内源性保护作用。而DFO组与DFO+SPostC组的HIF-1α蛋白表达明显升高，并且心肌梗死面积减少，这与Luciano等[11]的研究结论一致。说明HIF-1α可能是糖尿病状态下SPostC保护效果弱化的关键，去铁胺预处理能够激活糖尿病状态下受损的HIF-1α，去铁胺联合SPostC能够激活并上调糖尿病状态下受损的HIF-1α，从而发挥心肌保护作用。

VEGF是最重要的血管生成细胞因子，也是HIF-1α的下游靶基因，在缺氧性疾病的血管新生过程中扮演关键角色[12]。VEGF 作用于靶细胞-血管内皮细胞，具有一定的特异性，可通过促进内皮细胞进行有丝分裂及增殖，促进组织新生血管形成[13]。在心肌发生缺血时，VEGF表达增加[14]，可以通过囊泡小体介导的跨膜途径，引起血浆蛋白外渗，导致细胞外环境发生变化，提高血管的通透性[15]。研究发现，在非糖尿病状态下，七氟醚能够上调VEGF的表达，一方面能够促进血管重构和内皮化，另一方面还发挥抗炎作用[12]。本研究发现DFO+SPostC组与DFO组相比，VEGF表达水平明显增加，线粒体结构损伤程度较轻，心肌梗死面积明显减少，这提示去铁胺联合SPostC可能通过激活并促进糖尿病状态下HIF-1α的表达，上调下游靶基因VEGF的表达，最终减少心肌梗死面积，减轻缺血心肌的损伤。

综上所述，去铁胺预处理联合SPostC可以激活并促进 HIF-1α高表达，上调VEGF 的表达，增加缺血心肌的微血管密度，提高血管通透性，减少糖尿病大鼠的心肌梗死面积并改善心功能。本研究揭示了病理性心肌应用SPostC心肌保护作用弱化的分子机制，也为围术期应用SPostC实施病理性心肌保护提供了科学依据。