甲状旁腺激素相关肽改善小鼠心肌梗死后心脏功能的研究

甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)产生于哺乳动物的多种细胞类型，并通过自分泌、旁分泌及内分泌等形式调节细胞增殖、分化和凋亡[1-2]。外源性PTHrP具有扩张动脉的作用，可增加局部心肌血流量，在离体大鼠心脏中，PTHrP具有正性变时变力作用[3]。PTHrP可诱导人成骨细胞(hOB)和人骨肉瘤MG-63细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)[4-5]，同时还是与骨血管新生密切相关的溶骨因子，但PTHrP对心脏的作用，特别是对心肌梗死的作用仍不明确。

PTHrP在各种类型的血管平滑肌细胞(VSMC)中均有表达，当动脉受损或者发生粥样硬化时，其表达水平会显著上调[6]。研究表明，PTHrP的核定位序列(NLS)和C末端可抑制基因p27表达，调节VSMC增殖、迁移和凋亡，促进血管内膜新生[7]，因此NLS和C末端两者共同组成的PTHrP(87-139)片段对于缺血性心脏病可能具有潜在的价值。本研究旨在探讨PTHrP(87-139)对心肌梗死后心脏功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

33只体质量约为25 g的6～8周C57BL/6野生型雄性小鼠，由南京医科大学骨与干细胞实验中心SPF级实验动物中心饲养。本实验经动物实验伦理委员会审核通过。

将小鼠随机分为3组，每组11只。假手术组：小鼠开胸后对心脏前降支穿针但不进行结扎，1 d后腹部皮下注射生理盐水。心肌梗死组：结扎小鼠心脏前降支构建心肌梗死模型，1 d后腹部皮下注射生理盐水。心肌梗死+PTHrP组：结扎小鼠心脏前降支构建心肌梗死模型，1 d后腹部皮下注射PTHrP(87-139)，1 d后腹部皮下注射PTHrP(87-139)，剂量为80 μg/kg[8]。各组每日注射1次，持续注射4周后行后续实验。

1.2 心脏功能检测

高频超声图像系统(Vevo 2100, 加拿大Visualsonics公司)检测小鼠左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)。每个参数测量3次并且记录平均值。

1.3 心肌肥厚以及肺淤血程度评估

称量小鼠体质量后，分别取出小鼠的心脏和肺，清洗后称量心脏和肺的质量。计算心脏质量/体质量和肺质量/体质量的比值。

1.4 免疫组织化学染色检测CD31表达情况

将小鼠心脏心肌梗死边缘区(假手术组为针穿部位)冠状面切成片状，部分用于免疫组织化学染色以及马松染色，部分用于提取蛋白。

将石蜡切片浸入0.01 mol/L柠檬酸盐中进行抗原修复，滴加3%过氧化氢溶液后室温避光静置20～30 min，滴加10%正常羊血清，室温封闭60 min以上。加入抗CD31抗体(1∶400)，4 ℃孵育过夜后，置于37 ℃冰箱复温0.5 h，加羊抗鼠IgG二抗(1∶1 000)，室温孵育60 min。加Elite ABC配制液于切片上，室温孵育30 min，行二甲氨基偶氮苯(DAB)染色，苏木素复染，1%盐酸酒精液中分化2 s，冲洗，蓝化，酒精脱水，封片。每张病理切片于显微镜下取左上、右上、中间、左下、右下各2 个不重叠视野。使用软件Image-Pro Plus对图像进行定量分析，分别计算CD31阳性点个数，并取各组平均值。

1.5 马松染色检测心肌纤维化

马松染色按试剂盒内说明书操作：石蜡切片常规脱蜡至水，Weigert铁苏木素染色液染色5～10 min，酸性乙醇分化液分化5～15 s，Masson蓝化液返蓝3～5 min，丽春红品红液染色5～10 min，磷钼酸溶液洗1～2 min，苯胺蓝液染色1～2 min，酒精脱水，封片。每张病理切片于显微镜下取左上、右上、中间、左下、右下各2 个不重叠视野。使用软件Image-Pro Plus对图像进行定量分析，检测阳性面积和整个视野面积，计算阳性面积百分率=阳性面积/检测视野面积×100%，取各组阳性面积百分率平均值。

1.5 Western blot检测多种血管相关因子表达情况

提取蛋白，十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳，转膜，封闭，兔抗鼠VEGF抗体、血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)抗体、碱性成纤维生长因子(bFGF)抗体(均1∶200)4 ℃孵育过夜，羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)孵育2 h，洗膜后，滴加显影液，于Odyssey近红外双色扫描系统上显影，使用ImageJ软件分别测量各目标条带和内参GAPDH的灰度值，计算蛋白的相对表达水平。

1.6 统计学分析

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTHrP(87-139)改善小鼠心肌梗死后心功能

与假手术组相比，心肌梗死组LVEF、LVFS显著降低，LVEDD、LVESD明显升高；与心肌梗死组相比，心肌梗死+PTHrP组LVEF、LVFS、LVEDD、LVESD等指标明显改善(P均<0.05)，见表1。

表1 各组小鼠超声心动图指标比较

2.2 PTHrP(87-139)减轻心肌梗死后心肌肥厚

与假手术组相比，心肌梗死组心脏质量/体质量和肺质量/体质量的比值明显升高；与心肌梗死组相比，心肌梗死+PTHrP组心脏质量/体质量和肺质量/体质量的比值明显降低(P均<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠心脏质量/体质量和肺质量/体质量的比值比较/mg·g-1

2.3 PTHrP(87-139)改善缺血性心肌间质纤维化

马松染色结果，显示心肌梗死组[(14.69±1.28)%]心肌梗死边缘区的心肌纤维化程度较假手术组[(1.61±0.57)%]明显升高，心肌梗死+PTHrP组[(6.52±0.80)%]心肌纤维化程度较心肌梗死组明显降低(P均<0.05)，见图1。

注：A为假手术组；B为心肌梗死组；C为心肌梗死+PTHrP组

2.4 PTHrP(87-139)促进心肌梗死后血管生成

与假手术组相比，心肌梗死组心肌梗死边缘区CD31表达水平有轻微升高，但两组间差异无统计学意义[(59.17±4.91)个阳性点对(54.83±4.79)个阳性点，P>0.05]；与心肌梗死组相比，心肌梗死+PTHrP组CD31表达水平[(111.17±12.34)个阳性点]明显升高(P<0.05)，见图2。

注：A为假手术组；B为心肌梗死组；C为心肌梗死+PTHrP组

2.5 PTHrP(87-139)促进多种血管相关因子生成

与假手术组相比，心肌梗死组VEGF、VEGFR-2、bFGF表达水平明显降低；与心肌梗死组相比，心肌梗死+PTHrP组VEGF、VEGFR-2、bFGF表达水平则明显升高(P均<0.05)，见图3、表3。

3 讨论

改善心肌血供是治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)尤其是心肌梗死的重要策略[9]。PTHrP及其受体分布于人体的各个组织器官，并通过自分泌、旁分泌及内分泌的方式，调节组织器官的生长及分化过程。体外细胞实验及转基因小鼠实验表明，PTHrP参与调节细胞增殖、分化和凋亡，是骨骼、乳腺、牙齿和血管系统正常发育所必需的体液因子。研究证实，PTHrP具有促进血管生成的作用，能够增强多种细胞中VEGF的表达和分泌[10]，也能促进移植体血管生成[11]。去除PTHrP的NLS和C末端，会影响VSMC的细胞周期，抑制血管新生内膜的形成[12]，提示PTHrP(87-139)可促进血管内膜形成，进而刺激血管生成。

促进血管生成改善血供对于缺血组织来说非常重要[13]。VEGF可通过调节血管生成信号，促使不成熟或杂乱无序的血管形成稳定和具有功能性的微血管网络，从而恢复不同组织，特别是缺血组织的血流[14]。bFGF也是重要的血管生成因子，可诱导缺血心肌的血管生成，加快心肌梗死后的心脏修复[15]。在本研究中，小鼠持续皮下注射PTHrP(87-139) 4周后，心肌梗死边缘区VEGF、VEGFR-2和bFGF表达上调，表明PTHrP(87-139)能够促进血管生成。

图3 各组小鼠心肌VEGF、VEGFR-2、bFGF蛋白表达水平

表3 各组小鼠心肌VEGF、VEGFR-2、bFGF蛋白表达水平比较

CD31是一种血小板-内皮细胞黏附分子，作为内皮细胞标志物，可在一定程度上反映血管生成密度，本研究显示心肌梗死小鼠皮下注射PTHrP(87-139)后，心肌CD31表达水平上升，心功能改善，心肌间质纤维化程度降低，这表明PTHrP(87-139)对于抑制心肌梗死后重构具有重要意义。

PTHrP可舒张动脉血管床，如冠状动脉、胃肠道相关动脉、肾动脉以及肺动脉，而这种作用与VSMC腺苷酸环化酶的激活和一氧化氮(NO) 的产生密切相关[16]。PTHrP 前体通过转录后剪接可产生成熟的N末端、中段、NLS以及C末端[17]。研究表明，NLS能够进入细胞核发挥功能，刺激细胞增殖和抑制细胞凋亡，而C末端对于NLS发挥作用是不可或缺的[18]。PTHrP在NLS和C末端缺失时，可通过改变相关基因的表达，使细胞生长迟缓和早期衰老。NLS和C末端对于PTHrP发挥多种生理功能，尤其对促进VSMC增殖极为重要。然而，NLS和C末端组成的PTHrP(87-139)通过何种机制发挥以上作用，目前尚不明确，相关实验表明可能与其调节p27基因密切相关。