植物乳杆菌对重金属Pb2+、Cr6+ 和Cu2+的耐受性与吸附作用相关性比较

李 冉, 欧 杰,3*, 代启虎, 马晨晨

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，上海 201306；3.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海)，上海 201306)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 试验菌株由本实验室从四川矿区周围重金属污染严重区域的泡菜样品中分离、鉴定并保存。

1.1.2 试剂 MRS培养基、MRS肉汤，美国Sigma公司；重铬酸钾(优级纯)、Pb(NO3)2(分析纯)、Cu(NO3)2(分析纯)、 Pb标准溶液(1 mg/mL)、Cr标准溶液(0.5 mg/mL)、Cu标准溶液(0.5 mg/mL)等其他试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 仪器与设备 火焰原子分光光度计 (TAS-990，北京普析通用仪器有限责任公司)；台式酸度计(PHS-210E,杭州陆恒生物科技有限公司)；离心机(XZ-6G，湘智离心机仪器有限公司)；生化培养箱(LRH-150F，上海一恒科学仪器有限公司)；振荡培养箱(ZQLY-300，上海知楚仪器)。

1.2 方法

1.2.1 16S rDNA 菌种鉴定 将泡菜中分离得到的菌种P1提取DNA，送至生工生物工程(上海)股份有限公司做双向测序。将测序结果在 Gen- Bank 中通过 Blast 进行基因比对，获得相似度最高的序列，与测定序列通过Clustal X 进行多重序列比对，比对结果通过 MEGA 5.0 软件构建系统发育树。

1.2.2 铅、铬和铜储备液的配制 称取56.579 g 重铬酸钾、15.985 g Pb(NO3)2和29.516 g Cu(NO3)2，分别溶于1 L无菌蒸馏水中, 配制为重金属离子浓度为10 g/L的母液，用0.45 μm的滤膜过滤并于4 ℃冰箱内储存，以备后期吸附使用。

1.2.3 菌株的最小抑制浓度 (MIC) 测定 参考杨振兴等[11]的方法，采用MIC方法表征乳酸菌对重金属离子的耐受性。此方法可以直观地反映微生物对重金属的耐受性,且方便比较。如Muoz等[12]利用MIC方法表征工业废水中分离得到的微生物对Pb2+、Zn2+等离子的耐受性。实验重金属包括Pb2+、Cr6+和Cu2+，测试重金属的浓度梯度为0.1、 0.5、1.0、 1.5、 2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0 和32.0 mmol/L,每组设置3个平行实验。将分离得到的植物乳杆菌接种在MRS平板中, 生化培养箱中36 ℃培养48 h, 用接种环挑取单菌落悬浮在0.5 mL灭菌超纯水中，取1环悬浮液中的菌体在不同浓度的3种重金属平板上划线培养48 h，设置无重金属离子对照组，观察菌株的生长情况并记录MIC。

1.2.4 菌体收集及吸附 将分离得到的植物乳杆菌接种在MRS固体培养基上， 36 ℃培养48 h, 挑取单菌落接种到MRS肉汤培养基中， 36 ℃培养18 h， 4 745×g离心10 min后，收集菌体，用已灭菌超纯水4 745×g洗涤，重复3次，悬浮成100 g/L的菌悬液。

1.2.5 标准曲线的制作 取铅标准溶液 (1 000×10-6)、铬和铜标准溶液 (500×10-6) 配制成浓度为0、20.0×10-6、40.0×10-6、60.0×10-6、80.0×10-6和100.0×10-6的标准溶液, 用火焰原子分光光度计测其吸光度值, 以配制的标准液的浓度作为横坐标，其对应的吸光度为纵坐标，绘制出标准曲线图，根据标准曲线得出吸光度值与浓度的一元线性回归方程。

1.2.6 单因素吸附条件设定 植物乳杆菌对Pb2+、Cr6+和Cu2+的吸附效果测定，分别研究了溶液初始浓度、吸附时间、菌体用量和初始pH对3种重金属离子吸附效果的影响。具体实验过程如下：①溶液pH值对吸附的影响：将100 mg/L 的Pb2+溶液、Cr6+溶液 和Cu2+溶液,用0.5 mol/L HNO3或0.5 mol/L NaOH 调节pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，各加入菌体,使菌体浓度为1 g/L，36 ℃振荡吸附8 h，离心后除去菌体，测定上清液中离子浓度。②菌体用量对吸附的影响：在100 mg/L 的Pb2+溶液、Cr6+溶液 和Cu2+溶液中,分别加入菌体，使菌体浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L,于36 ℃、pH值为6的条件下振荡吸附8 h，离心除去菌体，测定上清液中离子浓度。③离子初始浓度对吸附的影响：在分别为10、20、50、75、100 和150 mg/L的Pb2+溶液、Cr6+溶液和Cu2+溶液中，各加入菌体，使菌体浓度为1 g/L，于36 ℃、pH值为6的条件下振荡吸附8 h，离心后除去菌体，测定上清液中离子浓度。 ④时间对吸附效果的影响：在浓度为100 mg/L 的Pb2+溶液、Cr6+溶液 和Cu2+溶液中,分别加入菌体,使菌体浓度为1 g/L，于36 ℃、pH值为6的条件下振荡吸附1、2、4、8、12、16、20和24 h后离心，去除菌体，收集上清液，放入4 ℃冰箱内，统一测定上清液中离子浓度。

1.2.7 仪器工作参数设定及样品的测定 火焰原子吸收分光光度计测定铅、铬、铜，所需条件如下:波长分别为228.8、359.3和324.8 nm, 狭缝0.15～0.2 nm, 灯电流4.0 mA, 燃气流量2 500 mL/min, 背景校正为氚灯。在测定标准液相同的实验条件下，吸取吸附后的上清液注入原子分光光度计中，平行测定3次。如果测定结果已超出标准曲线范围，则用1%硝酸溶液稀释至范围内后再重新进行测定。按以下公式计算铅、铬和铜的生物吸附率:

式中，Qr：吸附率(%)，C0：金属离子初始浓度(mg/L)，Ce：吸附后重金属离子最终浓度(mg/L)。

2 结果与分析

2.1 16S rDNA菌种鉴定结果

本实验室所分离得到的菌株提取基因组 DNA 经PCR 扩增后，产物均在 1 500 bp 左右，条带清晰且无杂带，可用于菌株16S rDNA 序列的测定。测序结果在 NCBI 基因序列数据库上进行 Blast 序列比对，将同源性较高的菌株用于构建系统发育树，结果如图1所示。筛选菌株P1与几株Lactobacillusplantarumstrain 具最高的序列同源性，结合菌株的形态、生理生化特征说明从泡菜中分离出的菌株P1属于植物乳杆菌。

2.2 MIC测定结果

由植物乳杆菌的MIC 测定结果可以发现，该植物乳杆菌对不同重金属的耐受程度具有显著的特异性。对3组最低抑制浓度数据结果用SPSS进行Qne-way ANOVA分析，结果如表1所示。3种重金属离子比较，其对Pb2+具有最大耐受性， MIC 为(6.67±1.155) mmol/L；其次是Cu2+，MIC为(2.17±0.764) mmol/L；Cr6+的最低抑制浓度最小，为(0.67±0.28) mmol/L 。

表1 植物乳杆菌的最小抑制浓度(mmol/L)

注：P<0.05，不同字母表示不同金属间具有显著性差异

2.3 标准曲线的制作

铅标准溶液的质量浓度分别为0、10.0、20.0、30.0、40.0和50.0 mg/L, 以铅离子的浓度作为横坐标,以样品的吸光度值作为纵坐标, 绘制出标准曲线的回归方程:y=0.018 2x+0.029 0, 拟合度R2=0.997 2。

铬标准溶液的质量浓度分别为0、20.0、40.0、60.0、80.0和100.0 mg/L, 以铬离子的浓度作为横坐标, 以样品的吸光度值为纵坐标, 绘制出标准曲线的回归方程:y=0.008 1x+0.032 4, 拟合度R2=0.993 2。

铜标准溶液的质量浓度分别为0、1.5、3.0、4.5、6.0和7.5 mg/L, 以铜离子的浓度作为横坐标, 以样品的吸光度值为纵坐标, 绘制出标准曲线的回归方程:y=0.066 4x+0.034 5, 拟合度R2=0.993 7。

图1 基于菌株 16S rDNA 序列构建的系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

2.4 单因素对Pb2+、Cr6+和Cu2+的吸附效果影响

2.4.1 pH对Pb2+、Cr6+和Cu2+的吸附效果影响 pH值为影响微生物细胞外聚合物(EPS, 指附着在细菌表面或围绕在细菌周围,用于自我保护和相互黏附的有机物质)吸收重金属的重要因素之一[13]。 图2为pH值对3种重金属离子吸附效果的影响，由于pH为中碱性范围时部分溶液会产生沉淀，本实验选取了2～6的pH作为研究范围。结果表明，pH对3种重金属离子的吸附均有较大的影响，其中Pb2+的影响最明显，Pb2+在pH为4时吸附率最高，达到了55%，该现象是由于在pH 值较低时，溶液中H+的含量增加，H+会与金属离子竞争结合位点；同时，细胞表面携带的官能团会被质子化，导致正电荷增加，从而使重金属离子的吸附量减少。pH 升高时，可以暴露出更多的磷酸基、羧基等负电基团，与带正电荷的金属离子结合，使得吸附量增加。但当溶液 pH 增加到一定程度时，金属离子也会形成氢氧化物沉淀，从而降低了吸附率。而本实验所测条件下，Cr6+和Cu2+在pH为6时达到吸附最高峰，此时吸附率分别为38%和12%。同一pH下对3种重金属的吸附效果不同，因为植物乳杆菌的胞壁上最多的蛋白是S-层蛋白，它含有多种负电荷的官能团，能选择性地结合金属离子。Schut等[14]利用蛋白酶 K将保加利亚乳杆菌的 S-层蛋白处理掉后，其结合铜、铁的量减少了，而锌和锰的结合率则上升。Comte等[15]的研究中也发现微生物吸附中，EPS结合位点的数量在不同pH下会有差异，而且菌体对不同重金属的结合位点数量也不同。因此，选取Pb2+、Cr6+和Cu2+的最适pH为4、6和6。

2.4.2 菌体浓度对Pb2+、Cr6+和Cu2+的吸附效果影响 图3为菌体用量对3种重金属离子吸附效果的影响。结果显示，随着菌体用量的增加，菌体对3种离子的吸附率提高，尤其在1～3 g/L区间，Pb2+和Cu6+的吸附率有明显的提升，而Cr6+的吸附率变化不大，Cr6+在3～6 g/L的菌体用量时，吸附率增加较快。在6 g/L时，菌体对3种离子的吸附均已达到平衡，为Pb2+、Cr6+和Cu2+的最高吸附率分别为96%、61%和49%。这是由于随着菌量的增加，导致了吸附位点增加,使得去除率升高，但是吸附率并不会随菌体用量的增加而成比例提高，菌体过量导致了吸附率下降，这种现象可能是由于生物量过大时，部分菌体细胞产生絮凝作用[16]，使得菌体本身无法充分分散在吸附体系中，反而减少了吸附位点以及吸附的表面积，从而使得吸附率平稳或降低。但考虑到经济效益问题，本研究选用最佳菌体用量为3、6和5 g/L。

图3 菌体质量浓度对Pb2+、Cr6+和Cu2+吸附率的影响 Fig.3 Effect of bacteria concenstration on the adsorption rate of Pb2+,Cr6+ and Cu2+

2.4.3 Pb2+、Cr6+和Cu2+初始浓度单独吸附效果影响 图4为各重金属初始离子浓度对吸附效果的影响。结果表明，随着初始浓度的升高，重金属离子的吸附率均降低，但吸附量会有所增加。在10～30 mg/L之间，吸附率下降最快，50 mg/L后吸附速率下降均减慢。这是因为较高的初始离子浓度使得菌体与底物之间发生相互作用的可能性更大，导致了底物的吸附量随浓度的增加而增加的现象。但当菌体的重金属结合位点数量一定时，浓度升高，结合位点已经趋近饱和，过量的重金属离子不能被吸附，结合率逐渐又下降,有研究[17]表明过高的重金属离子迫使细胞膜结构和功能破坏较严重，致使细胞膜通透性增加。在150 mg/L的初始浓度下，3种重金属离子的吸附率均已不足20%， 因为Pb2+、Cr6+和Cu2+的量已经多于细胞表面的吸附位点,因此3种重金属离子被吸附的百分比较低。本研究确定Pb2+、Cr6+和Cu2+的最优初始离子浓度分别为100、100和50 mg/L。

2.4.4 接触时间对Pb2+、Cr6+和Cu2+的单独吸附效果影响 微生物吸附重金属过程一般情况可分为两个阶段。反应初期时，由于细胞表面存在大量的结合位点，导致该阶段的金属离子可以被快速吸附。随着反应时间的延长，吸附率的增加逐渐变缓，金属被转运至胞内，最终达到平衡，该阶段可称为生物积累。这种现象可能是因为随着时间的不断增加，菌体表面的吸附活性位点已经逐渐达到饱和，吸附的过程中还可能存在部分解析现象。由图5可以看出，Cr6+与Pb2+和Cu2+相比更早的达到吸附平衡，在4 h左右时吸附稳定，后期趋于平稳。随后8 h左右时，Cr6+达到吸附平衡，而Pb2+在16 h 才达到吸附稳定期，原因可能是植物乳杆菌的结合位点可以快速高效的结合Cr6+，而对Pb2+和Cu2+的吸附在第一阶段相对于Cr6+吸附较为缓慢，后者吸附主要是发生在第二阶段。因此，本研究确定Pb2+、Cr6+和Cu2+的最佳吸附时间为12、2和8 h。

图4 Pb2+、Cr6+和Cu2+的初始浓度对吸附效果的影响 Fig.4 The effect of initial concentration of Pb2+，Cr6+ and Cu2+ on the adsorption effect

图5 接触时间对吸附Pb2+、Cr6+和Cu2+的影响 Fig.5 The effect of contact time on the adsorption ofPb2+，Cr6+ and Cu2+

3 讨 论

目前所报道的对重金属具有较高耐受性的微生物大部分是从环境中筛选得到的，很少从食品中分离得到。本研究从泡菜中筛选得到的对重金属Pb2+、Cr6+和Cu2+具有较高耐受性的菌株P1，通过对其形态特征、生理生化性质鉴定表明菌株P1与菌株鉴定手册中植物乳杆菌的描述较为接近。16S rDNA序列分析和系统发育树的构建揭示了菌株P1与植物乳杆菌亲缘关系较近，因此，综合菌株的形态、生理生化和16S rDNA序列分析结果，认为分离到的菌株P1是1株植物乳杆菌。

测定3种重金属离子对该菌的最小抑制浓度，使用原子吸收方法测定不同条件下该植物乳杆菌对重金属Pb2+、Cr6+和Cu2+吸附效果，实验结果显示，该植物乳杆菌对3种重金属离子的吸附效果有显著差异，但与其对3种重金属的耐受性并没有正相关的关系，其耐受性为Pb2+>Cu2+>Cr6+，而吸附效果为Pb2+>Cr6+>Cu2+。与已有报道[8-9]一致，如翟齐啸[20]的研究中，干酪乳杆菌CCFM30，虽然具有较好的镉吸附能力，但对镉的MIC仅为50 mg/L，这可能是由于MIC与重金属吸附的作用机制不同导致的。本研究中，该植物乳杆菌对Pb2+的最优单因素吸附条件为吸附时间12 h、菌体用量3 g/L、pH 4、初始铅离子浓度100 mg/L，吸附率最高可达96%；对Cr6+的最佳吸附条件为吸附时间4 h、菌体用量6 g/L、pH 6、初始铬离子浓度100 mg/L，吸附率最高可达69%；对Cu2+的最佳吸附条件为吸附时间8 h、菌体用量5 g/L、pH 6、初始铬离子浓度100 mg/L，吸附率最高可达49%。该植物乳杆菌是一种高效安全Pb2+、Cr6+和Cu2+的吸附剂，在今后含乳酸菌食品及饲料制剂的开发应用中具有潜在的应用价值。而在消化道中多种因素的共同影响下，该菌能否发挥其有效的脱除作用仍需进一步探索。