奶牛源乳酸菌的分离、鉴定及其微生态制剂的研究

桑梦琪， 喻 琴,2， 邵 丹， 董书伟， 王东升， 张世栋， 武小虎*， 严作廷*

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 甘肃省中兽药工程技术研究中心，甘肃 兰州 730050；2.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

奶牛子宫内膜炎是危害奶牛生产的主要繁殖疾病。引起奶牛子宫内膜炎的因素较多，其中病原微生物的感染是主要因素之一，引起奶牛子宫内膜炎的病原菌主要有大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、化脓隐秘杆菌以及少量的沙门氏菌。近年来的研究表明引起奶牛子宫内膜炎主要原因是栖居在生殖系统内的菌群平衡被打破，导致乳酸菌等益生菌菌株减少，而其他病原微生物大量繁殖，从而引发子宫内膜炎。发生子宫内膜炎的奶牛性周期发生紊乱，发情周期紊乱，并由于子宫等炎症的影响，精子活力降低，影响受精卵及胚胎着床，最终导致奶牛不孕，繁殖率降低，产奶量下降[1-3]，成为严重危害奶牛业发展的四大疾病之一[4-5]。近年来微生态制剂以绿色、健康、无污染等特点逐渐引起人们的关注。目前关于益生性的乳酸菌分离已有少量报道，分离到多种诸如乳酸杆菌、乳酸球菌、粪肠球菌等可以抑制病原微生物的益生菌株[6-8]，这些菌株成为研究微生态制剂的最好材料。田丰松等[9]从健康奶牛的阴道样本中分离鉴定出乳酸菌，得到有较好的抑菌能力和产酸性能的菌株，抑菌试验显示能抑制大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌株的生长。朱芬花等[10]研究发现从健康奶牛阴道内筛选分离并鉴定出的乳酸菌，菌株均具有较好的产酸能力，试验显示产酸能力越强抑菌能力越强。李向楠[11]从健康奶牛生殖道中分离并鉴定出4株具有益生功能的乳酸菌，产酸性能较好，有一定的产H2O2能力。单一菌株和复合菌株对大肠埃希菌的抑菌效果是不同的，菌株存在不相容性。从抑菌试验来看，可能增强也可能减弱。赵静等[12]采用同样方法，也获得了从宿主分离纯化出的益生菌复合效果较强于单一的益生菌。这些研究的参考意义在于可以考虑多种益生乳酸菌制成复合的微生态制剂来进行更好的防治，同时考虑乳酸菌之间的相容性，避免出现益生菌之间的拮抗影响制剂效果，最大化益生菌的安全性[13]。本研究以产后30～50 d健康奶牛的子宫颈口处分泌物为菌源，通过分离鉴定和抑菌、生长及产酸能力试验，以期筛选防治奶牛子宫内膜炎能力强的益生乳酸菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌源样品 乳酸菌菌源子宫黏液样品均采集自甘肃省荷斯坦奶牛繁育示范中心和燎原乳业集团丰源养殖基地，产后30～50 d的健康荷斯坦奶牛；大肠埃希菌为中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所兽医实验室分离和保存。

1.1.2 培养基与试剂 MRS培养基、MRS肉汤、营养肉汤、伊红美兰培养基、TE缓冲液、10%SDS、1%的琼脂糖凝胶、酚/氯仿/异戊醇、异丙醇和M0401通用细菌采样管；16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(TaKaRa)、DNA提取试剂盒(Omega)；细菌生化鉴定管(广东环凯微生物科技有限公司)。

1.1.3 仪器与设备 LAI-3-T厌氧培养箱、Alphaclean 1300垂直流洁净工作台、隔水式恒温培养箱、电冰箱、DHG-9035A电热鼓风干燥箱、LDZX-30KB立式压力蒸汽灭菌器、HH-4数显恒温水浴锅、Thermoscientificnanodrop2000超微量核酸测定仪、WP-UPL超纯水机、SEDI-G PCR扩增仪、游标卡尺、电泳仪、Azure biosystems凝胶成像系统、梅特勒-托利多便携式pH计Five go F2等。

1.2 方法

1.2.1 样品采集与增菌培养试验 选择健康的产后奶牛，采集子宫颈口处黏液2～8 mL迅速注入配制好的MRS液体培养基的试管中，置于冰盒中4 h内带回实验室，接种MRS乳酸菌选择性平板，置于厌氧培养箱中，于0.5%～1.5%低氧气浓度下，37 ℃增菌培养。

1.2.2 分离和纯化 经过18～24 h初步增菌后，于厌氧操作台中，用一次性接种棒挑取具有乳酸球菌或乳酸杆菌典型菌落形态的菌落分别划线接种于MRS平板，将平板倒置在厌氧培养箱内，37 ℃培养18～24 h。如此反复挑划单菌落，连续传代接种2～4次，直至平板上出现菌落形态、大小、颜色一致，且通过染色镜检时菌落形态单一，无杂菌。挑取已纯培养的菌落接种MRS液体培养基，37 ℃培养16～18 h，镜检确定菌落形态单一，染色特性一致，即可将菌株进行冻存，或者暂存于4 ℃，以便用于下一步试验[14]。

1.2.3 革兰染色和镜检 参考《兽医微生物学实验指导》[15]对各分离菌株进行革兰染色和镜检。

1.2.4 触酶试验 将1滴3%的H2O2滴于干净的载玻片上，用接种环挑取1环培养18 h的单菌落浸泡在新配制好的H2O2溶液中并进行涂抹，若有气泡出现则为阳性，无气泡为阴性。

1.2.5 生化鉴定 用乳酸菌细菌生化鉴定管对分离菌株进行生化鉴定：挑取疑似乳酸菌新鲜纯培养菌落，用无菌生理盐水稀释至6×108cfu/mL，各取0.05～0.08 mL的菌悬浊液加入到每种微量西林瓶中，套上胶塞，37 ℃培养24～48 h后观察结果。

1.2.6 乳酸菌DNA的提取 按照Omega DNA提取试剂盒说明书提取细菌基因组DNA，获得的DNA经超微量分光光度计测定浓度后，于-20 ℃保存。

1.2.7 乳酸菌16S rDNA扩增 采用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit试剂盒，PCR扩增反应体系为25 μL：模板1 μL，PCR Premix 12.5 μL(包含TaKaRa ExTaq、反应用Buffer、dNTP Mixture等)，上游引物和下游引物各0.25 μL，16S-free H2O 11 μL。阴性对照使用1 μL的16S-free H2O替代模板DNA，阳性对照取1 μL的Positive Control DNA 作为模板。PCR反应程序：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性1 min;58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃终延伸10 min；4 ℃保温。预先制备好1.0%的琼脂糖凝胶，扩增反应完毕后，取6 μL PCR产物与2 μL上样缓冲液混合，电压120 V电泳30 min后，Azure Biosystems 凝胶成像仪下观察和扫描图像。

1.2.8 16S rDNA序列测定及分析 将获得的PCR产物送北京华大科技股份有限公司进行测序，将得到16S rDNA全序列采用DNAstar 7.1软件组件Seqman对测序结果进行拼接，删除上下游引物对应序列后保存。使用NCBI在线数据库中的核酸序列Blast进行比对，以确定各分离菌株的物种归属。

1.2.9 单株细菌上清抑菌试验 ①乳酸菌上清的制备：参考刘冬梅等[16]、李向楠[11]报道并进行改进，采用琼脂扩散法检测各分离菌株对大肠埃希菌抑菌能力。将乳酸菌接种于MRS液体培养基，37 ℃培养18 h后，8 000 r/min离心20 min，取上清用0.22 μm细菌滤器过滤除菌，立即使用或冻存于-80 ℃备用。②抑菌试验：将牛津杯放在制备好的MH药敏试验平板上，平板上均匀涂布0.2 mL的108cfu/mL致病菌菌液，吸取0.2 mL乳酸菌上清，加入上述MH平板的牛津杯内，将平板于37 ℃培养18～24 h后，用游标卡尺测量抑菌圈大小，每组实验设立3个重复。具有抑菌能力的乳酸菌上清会在牛津杯周围形成一个透明的抑菌圈，抑菌圈的直径越大，则对应菌株对致病菌的抑制能力越强；不具备抑菌活性的乳酸菌上清，在牛津杯周围没有抑菌圈，细菌均匀生长。

1.2.10 混合上清抑菌试验 将得到的乳酸菌厌氧培养18 h收集上清，按照0.2 mL的总量将上清分别进行等量混合，放置备用。具体方法同1.2.9，混合上清加入牛津杯放到均匀涂布有指示菌的平板上，37 ℃需氧培养18～24 h，用游标卡尺测量抑菌环直径，并进行记录和分析。

1.2.11 生长曲线 每株菌株对应13支试管，试管的编号标明培养时间：0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24 h。用移液器吸取1麦氏单位的乳酸菌5 mL接入盛有100 mL培养基(MRS)的三角瓶中，混合均匀后分别吸取2 mL菌液放入上述标记好的13支试管中(每2 mL的复合液对应0.2 mL的1麦氏单位乳酸菌菌液)。将已接种的试管用纱布包好后放入厌氧培养箱内，37 ℃静置培养，分别于培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h后以标记的时间依次将试管取出，用未接种的MRS液体培养基做空白对照，测量其OD600光密度值，紫外分光光度计在600 nm波长下进行比浊测定。培养液测定前用涡旋振荡器摇匀，依次测定OD600值。记录试验结果，用MS Excel绘制表格。以时间为横坐标，OD600为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。最佳生长温度的测定试验方法同上，查阅《伯杰式细菌系统学手册》，乳酸菌最佳生长条件约35～40 ℃。因此设置35、37、39、41 ℃四个梯度。单个菌株制备13支培养基试管并标记好时间和菌号，培养18～24 h后，测量、记录并用Excel绘制菌液生长曲线。

1.2.12 产酸能力曲线 按照1.2.11得到每株菌株的最佳培养温度，在最佳温度培养下进行产酸能力的测定。试验方法同上，单个菌株选取13支培养基试管并标记好时间和菌号(1.2.11得到每株菌的最佳培养时间：生长到对数期时间)，培养后用pH计分别测量各个试管的pH值(室温),以时间为横坐标，pH值为纵坐标，Excel绘制细菌产酸能力曲线。

2 结果与分析

2.1 分离乳酸菌菌株革兰染色镜检

由图1可知，分离菌株均为革兰阳性细菌。其中，6、7号菌株镜检为阳性杆菌，宽0.5～0.8 μm，长约2～9 μm，单个或者成链出现。3、11、13、23号菌株镜检为阳性球菌，直径0.5～1.2 μm。与《伯杰式细菌系统学手册》中乳酸杆菌、乳酸球菌的描述一致。可初步判定为乳酸菌。

2.2 菌株生化鉴定

分离菌株生化鉴定详细数据见表1。触媒试验均为阴性。根据细菌生化鉴定管说明书对分离菌株生化鉴定结果进行判定。将这些菌株接种七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨酸、山梨醇、蔗糖、棉子糖。结合生化鉴定结果，6号菌株七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、山梨醇、蔗糖、棉子糖发酵结果为阳性，甘露醇、水杨酸发酵结果为阴性，疑似为德式乳杆菌；7号菌株七叶苷、纤维二糖、山梨醇、蔗糖、棉子糖发酵结果为阳性，麦芽糖、甘露醇、水杨酸发酵结果为阴性，疑似为干酪乳杆菌；其他菌株生化鉴定未确定是哪种乳酸菌，需进一步鉴定以明确其种属归类。

表1 细菌生化鉴定结果

注：“+”为阳性，检测菌株能够发酵或利用七叶苷、纤维二糖、麦芽糖等上述8种物质；“-”为阴性，检测菌株不能发酵或利用上述物质

2.3 16S rDNA基因扩增

如图2所示，标识3～15为需要测序的乳酸菌株凝胶电泳结果，约1 500 bp。所得乳酸菌16S rDNA条带单一、清楚，没有拖尾现象，PCR扩增产物可用于后续测序分析。

图2 分离菌株16S rDNA凝胶电泳图Fig.2 PCR amplification of 16S rDNAM1：2 000 bp DNA Marker；M2：1 000 bp DNA Marker；1：阴性对照16S-free H2O2；2：阳性对照 1 100 bp；3：24号菌株；4：23号菌株；5：22号菌株；6：21号菌株；7：15号菌株；8：14号菌株；9：13号菌株；10：12号菌株；11：11号菌株；12：10号菌株；13：7号菌株；14：6号菌株；15：3号菌株M1：2 000 bp DNA marker; M2：1 000 bp DNA marker; 1：negative control 16S-free H2O2; 2：positive control 1 100 bp; 3：strain 24; 4：strain 23; 5：strain 22; 6：strain 21; 7：strain 15; 8：strain 14; 9：strain 13; 10：strain 12; 11：strain 11; 12：strain 10; 13：strain 7； 14：strain 6; 15：strain 3

2.4 测序比对

结合之前得到的生化鉴定结果，将分离菌株与NCBI 上分离菌株16S rDNA序列在线比对结果，确定7号菌株为乳酸杆菌，其与鼠李糖乳杆菌Lactobacillusmucosae(登录号：NR_024994.1)的同源性为98%；6号菌株与胃乳酸杆菌Lactobacillusgastricus(登录号：NR_029084.1)同源性达到98%；3号和23号菌株与乳球菌Lactococcuslaudensis(登录号：NR_136466.1)同源性均为98%；但3号和23号菌株的生化鉴定结果不一致，推测可能是不同的种；10号菌株与海氏肠球菌Enterococcushirae(登录号：LC 119115.1)同源性达到99%；11号菌株与魏斯氏细菌Weissellacibaria(登录号：KU302758.1)同源性达到99%；13号菌株与粪肠球菌Enterococcusfaecalis(登录号：MF369837.1)同源性达到99%。

2.5 单株细菌抑菌试验

经37 ℃、18～24 h恒温孵育，共筛选出对大肠埃希菌具有较强抑菌能力的菌株5株，依次为3号、6号、7号、11号、13号、23号菌株。各分离菌株提取上清对致病性大肠埃希菌的抑制情况详见表2。

表2 分离乳酸菌上清抑制致病性大肠埃希菌结果

2.6 混合菌株抑菌试验

采用混合上清对大肠埃希菌进行抑菌实验，结果显示，7号、11号和13号的上清具有协同作用，也就是鼠李糖乳杆菌、魏斯式细菌和粪肠球菌混合上清的抑菌效果最好；3号、6号和11号也具有协同作用，其抑菌效果好于单菌和两两混合的效果；其他试验结果显示混合的没有单一或者两两混合的好，具体表现在混合的3号和6号、混合的3号和23号、混合的6号和11号、混合的7号和11号均没有单一上清的抑菌效果好。混合乳酸菌菌株对大肠埃希菌抑菌试验结果见表3，表中未写出的组合表示未测到试验结果(如6+7)。

表3 混合乳酸菌上清抑制致病性大肠埃希菌结果

2.7 生长曲线测定

分别测量7号鼠李糖乳杆菌、11号魏斯式细菌和13号粪肠球菌在各个温度下的生长曲线。结果发现7号鼠李糖乳杆菌OD600最高值为1.561 2，39 ℃时为其最佳生长曲线，39 ℃下，到对数期的时间约16 h，见图3A；11号魏斯式细菌的OD600最高值为1.561 2，39 ℃时为其最佳生长曲线，39 ℃下，到对数期的时间约18 h，且41 ℃下出现了OD值偏小，生长缓慢，因此试验得到的魏斯式细菌培养温度不能超过41 ℃，见图3B；13号粪肠球菌的OD600最高值为0.801 4，37 ℃时为其最佳生长曲线，37 ℃下，到对数期的时间约16 h，见图3C。

图3 菌株生长曲线Fig.3 Strain Growth curvesA：不同温度下鼠李糖乳杆菌的生长曲线；B：不同温度下魏斯式细菌的生长曲线；C：不同温度下粪肠球菌的生长曲线A： the growth curve of Lactobacillus mucosae at different temperatures; B： the growth curve of Weissella cibaria at different temperatures; C： the growth curve of Enterococcus faecalis at different temperatures

2.8 产酸能力试验

根据得到的3株菌株的最佳生长温度，得到每株菌株的产酸能力曲线(图4)。培养基初始pH为5.85，培养液MRS液体培养基均为2 mL，在同样的厌氧环境及最佳生长温度下进行培养后，粪肠球菌产酸曲线斜率最大，0～8 h斜率最大产酸能力最强，8 h后产酸能力直线下降，18 h趋于稳定达到pH约4.2(图4C)；魏斯式细菌产酸曲线分三段，0～6 h曲线斜率大，产酸能力最强，6～16 h产酸能力降低，18～24 h几乎不产酸(图4B)；鼠李糖乳杆菌产酸能力分两段，0～14 h产酸能力稳定呈线性，14 h后产酸能力逐渐消失(图4A)。

图4 菌株产酸能力Fig.4 Acid production capacity of strainsA：最适温度39 ℃下鼠李糖乳杆菌的产酸能力曲线；B：最适温度下39 ℃魏斯式细菌的产酸能力曲线；C：最适温度下37 ℃粪肠球菌的产酸能力曲线A：the acid production ability curve of Lactobacillus mucosae at the optimum temperature of 39 ℃; B：the acid production ability curve of Weissella cibaria at the optimum temperature of 39 ℃; C：the acid production ability curve of Enterococcus faecalis at the optimum temperature of 37 ℃

3 讨 论

我国有源远流长的乳酸菌利用的历史，在食品以及饲料添加剂中都有乳酸菌的应用[17]。本研究从产后健康奶牛的子宫颈口采集样品，通过分离、培养、染色镜检、生化鉴定得到乳酸菌，这些乳酸菌作为益生菌应用于微生态制剂中，来源于奶牛机体，又利用在奶牛机体上，更有利于其在奶牛生殖道内的定殖及作用。本研究分离纯化得到具有抑制大肠埃希菌的益生性乳酸菌共6株，经过提取16S rDNA全序列测序和序列比对，确定得到的菌株为乳酸菌，而这些菌株中鼠李糖乳杆菌、粪肠球菌、魏斯式细菌都已经有文献报道和研究[14，18]，从奶牛中得到的乳酸菌取于机体又利用于机体，能更好更安全地应用在微生态制剂的制作中。

乳酸菌是动物体内的常驻细菌，能定殖在机体形成屏障，使其他病原微生物无法定殖[19-20]；此外还能分泌多种生物活性物质如甲酸、乙酸、乳酸、过氧化氢，以及细菌素等，这些产物能够酸化微环境，抑制生殖道微环境中其他微生物的生长和繁殖，从而起到维持阴道和子宫颈微生态环境稳定和宫颈健康的效果。本研究参考田丰松等[9]和李向楠[11]报道的有关益生菌特性研究的方法，进行了适当的优化。根据乳酸菌的基本生物学特性，以MRS培养基结合厌氧培养作为乳酸菌培养条件，通过高速离心和0.22 μm细菌滤膜过滤的方法，更快地得到了优质无菌的细菌培养物上清。从抑菌实验结果来看，乳酸菌培养上清对大肠埃希菌具有一定抑制作用，这与薛洋洋[14]、Parolin等[21]试验得到的结论相符。同时，本研究中乳酸菌株对致病菌的抑菌圈大小与文献报道[22-24]的结果不尽相同，这可能与试验方法，试验所使用的乳酸菌来源、生存环境和测试致病菌株本身的特性有关。而混合抑菌试验结果说明，并不是将益生菌混合就会增强对致病菌的抑制效果，相反有些混合的比例还会导致抑菌圈变小，抑菌能力削弱，即不同细菌可能存在不相容性，这与文献报道一致[11，25]，因此对于混合菌株制作微生态制剂一定要谨慎试验和选择。

这些试验表明了乳酸菌制剂为细菌性奶牛子宫内膜炎的防治研究提供了一种新的方法。

结合《伯杰式细菌系统学手册》，从4个不同温度下以OD600值生长曲线来看，魏斯式细菌最适温度为39 ℃，最适温度下生长到对数期需要18 h，在39 ℃厌氧培养下培养液pH从5.85降到4.55，而pH趋于稳定只需要16 h，从益生菌培养角度来说得到的魏斯式细菌的培养条件可以优化为39 ℃下16 h；鼠李糖乳杆菌最适温度为39 ℃，在39 ℃下生长到对数期需要16 h，pH趋于稳定只需要14 h，鼠李糖乳杆菌的主要抑菌成分不是酸，从益生菌培养角度来说鼠李糖乳杆菌的培养条件优化为39 ℃下16 h，此时培养液pH从5.85降到4.21；粪肠球菌最适温度为37 ℃，在37 ℃下生长到对数期需要18 h，pH趋于稳定只需要12 h，培养液pH从5.85降到4.53，粪肠球菌的主要抑菌成分是有机酸类，从益生菌培养角度来说粪肠球菌的培养条件可优化为37 ℃下12 h。

本研究中分离获得的鼠李糖乳杆菌、魏斯式细菌和粪肠球菌作为益生菌种,在动物微生态制剂中的应用效果如何, 还需要进一步做动物安全性试验和饲养试验才能确定。

本研究从健康奶牛子宫颈口黏液中分离纯化出益生性乳酸菌，经上清抑菌试验最终筛选出6株具有良好的抑制致病性大肠埃希菌的活性乳酸菌株，分别是鼠李糖乳杆菌、胃乳酸杆菌、海氏肠球菌、魏斯式细菌、粪肠球菌，菌株上清混合试验得到最佳的抑菌效果配伍组成并得到了这些细菌的生长曲线和产酸能力，为今后进一步开发用于防控奶牛子宫内膜炎的微生态制剂提供了实验材料。