大连市售鲅鱼干化学及微生物指标分析

张雨晴，李颖，白婷婷，牟光庆，妥彦峰

（大连工业大学食品学院，辽宁大连116034）

随着我国海产品消费市场的逐步扩大以及人民生活水平的提高和健康意识的加强，人们对海产品的安全越来越重视。现在，应用最广泛的海产品保鲜的方法是低温保鲜技术，但是单一的低温保鲜技术存在着保鲜周期短、能耗高的各种问题，而腌制作为人们常用的水产品贮藏方法，却鲜有研究。

鲅鱼又被称为马鲛，类属鲅科，体型细长扁平，具有银色的体表。日常食用对治疗一些病症如营养不良、贫血、早衰、产后虚弱和神经衰弱等症状都会有一定的辅助治疗功效[1]鲅鱼干，顾名思义是将鲅鱼腌渍后晒干而成的干制品。咸干鲅鱼具有风味独特、易于贮藏的特点，但目前加工方式仍以手工作坊式加工和自然晾晒为主，产品存在含盐量高、风味不稳定等质量问题，因此需要对腌制鱼的品质进行评价。王睿迪等[2]对咸鲅鱼干品质的研究中发现挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量偏高，硫代巴比妥酸值（thiobarbituric acid，TBA）值为10.00 mg/kg，脂质氧化程度在感官可接受的范围内。周星宇[3]在研究中发现另一种腌制鱼类腌制鲐鱼盐度越高（8.27%），水分活度越低（0.874），越有利于样品保藏。

传统的水产品保藏方式腌制是在操作过程中加入食盐，而一定程度的盐分可以起到杀菌的作用。但是由于整个操作并不是在无菌环境中进行，很有可能在操作中带入一些其他的微生物。要明确了解这种贮藏方式是否合理，我们需要检测水产品在该种保藏方式之后的各项指标，如氨基酸态氮、酸价等指标从而确定鲅鱼干是否适合人们食用。本试验采集大连不同农贸市场销售的鲅鱼干，对其进行菌落总数、挥发性盐基氮、pH值、脂肪氧化值、酸价、盐分、水分的测定进而得出结论。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料1（新鲜鲅鱼）：大连某超市。原料2（制作后储藏期短的新鲜鲅鱼干）：大连庄河市。原料3（制作后储藏期短的新鲜鲅鱼干）：大连长兴生鲜市场；原料4（制作后储藏期较长的鲅鱼干，即晾晒时间较长，水分含量较低的鲅鱼干）：大连市辛寨子综合市场。

本试验所有鲅鱼干均是由重量为800 g～1 500 g的新鲜鲅鱼，由背部切开，去内脏和腮，在剖开的鱼肉表面撒一层食盐，室外自然晾晒而成。

平板计数琼脂、结晶紫中性红胆盐琼脂：北京陆桥技术有限责任公司；蛋白胨：北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化镁：天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸钾、铬酸钾：天津市光复科技发展有限公司；琼脂：福建金燕海洋生物科技股份有限公司；丙三醇、无水碳酸钾、硼酸、甲醇、氨水：天津市大茂化学试剂厂；2-硫代巴比妥酸：上海江莱生物科技有限公司；三氯乙酸、无水乙醚：国药集团化学试剂有限公司；盐酸：北京化工厂；无水乙醇：天津市富宇精细化工有限公司；β-巯基乙醇：天津市福晨化学试剂厂；氢氧化钠、氢氧化钾：天津市东丽区天大化学试剂厂。

1.2 仪器设备

电子天平、pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；自动高压灭菌器：日本拓美公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；冷冻离心机：艾本德（中国）有限公司；全波长酶标仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；高效液相色谱：安捷伦科技有限公司；旋涡混合器：美国IKA。

1.3 方法

1.3.1 菌落总数及腐败微生物菌落数的测定

根据夏秀东等[4]方法稍加修改进行测定。取4℃冷藏下的4种鲅鱼原料，在无菌条件下各称取5 g充分研磨加入10 mL无菌生理盐水中，摇匀静置，用无菌生理盐水对上清进行10倍梯度稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度的稀释液。取 100 μL 适当稀释度的稀释液，在营养琼脂平板上进行涂布，每个稀释度3个平行，然后在适当温度下培养，使其长出单菌落。

平板计数琼脂培养基：称取23.5 g培养基溶解于1 L蒸馏水中，121℃灭菌20 min后倾注平板。

Pseudomonades培养基：称取20 g蛋白胨，1.4 g MgCl2，1 g硫酸钾，13.6 g琼脂，10 mL丙三醇溶于1 L蒸馏水中，121℃灭菌20 min后倾注平板。

结晶紫中性红胆盐琼脂培养基：将41.6 g溶于1 L蒸馏水中，加热煮沸灭菌，冷却至50℃后倾注平板。测定鲅鱼干中不同微生物的具体培养基和培养条件如表1。

表1 微生物的种类及具体培养基和培养条件Table 1 Types of microorganisms and specific media and culture conditions

1.3.2 挥发性盐基氮（TVB-N）的测定

分别称取本试验中4种不同鲅鱼原料3.00 g，加入30 mL去离子水中并振摇，混合均匀后浸渍30 min，离心（6 000 r/min，12 min，4℃）取上清，上清液置于4℃冰箱中冷藏备用。挥发性盐基氮（TVB-N）根据GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》[5]中第三法：微量扩散法稍加修改进行测定。

1.3.3 pH值的测定

称取搅碎的样品10 g溶于100 mL蒸馏水中，振荡摇匀后浸渍0.5 h后离心，取约50 mL上清液，用pH计测其pH值。

1.3.4 TBA的测定

参考Witte等[6]方法稍加修改进行测定。称取4种不同鲅鱼样品1.00 g，搅碎后加入5 mL 0.02 mol/L的2-硫代巴比妥酸（TBA），沸水浴20 min，待溶液变成粉红色后，在流水中进行冷却，之后放入离心机中离心，离心条件为4℃，8 000 r/min，15 min。离心结束后在532 nm测上清液的吸光度，记录吸光值，记为A532。TBA以每千克样品中丙二醛的毫克数来表示，公式为：

1.3.5 酸价的测定

酸价的测定采用赵东豪等[7]的方法稍加修改进行测定。分别称取本试验中4种不同鲅鱼原料5 g，将样品搅碎，置于50 mL离心管中，加入15 mL乙醚-乙醇混合溶剂（2∶1，体积比），涡旋振荡直至均匀，超声提取20 min后，在4 500 r/min条件下离心分离5 min，取上清于锥形瓶中，用上述方法再提取残渣2次，合并上清液后供测定使用。在提取溶液中加入2滴～3滴酚酞指示剂，当氢氧化钾溶液滴定至粉红色，10 s内不褪色即为终点，记录所需的氢氧化钾标准溶液的体积。样品做3个平行，同时做一个空白对照。

氢氧化钾溶液的标定：称取0.3 g干燥值恒重的基准邻苯二甲酸氢钾，加入40 mL蒸馏水使之溶解，加入2滴酚酞指示剂，滴定至溶液呈粉红色，30 s不褪色，即得到标定出氢氧化钾的浓度。

酸价测定结果用公式为：

式中：V为所用氢氧化钾标准溶液的体积，mL；c为所用氢氧化钾标准溶液的准确浓度，mol/L；56.1为氢氧化钾的摩尔质量，g/mol；m为试样的质量，g。

1.3.6 盐分的测定

盐分的测定采用翟毓秀等[8]的方法稍加修改进行测定。

1.3.7 水分的测定

本试验样品中水分的测定用直接干燥法，参照GB5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》[9]稍加修改进行测定。

1.3.8 氨基酸态氮的测定

氨基酸态氮通过邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）法测量。将本试验中4种不同鲅鱼原料打碎，称取1.00 g溶于20 mL蒸馏水，调至pH值为4.6，在室温下静置30 min后离心，离心条件为3 000 r/min、30 min。取50 μL上清液，加入1 mL邻苯二甲醛试剂，室温反应2 min。在吸光度340 nm处测定吸光度。邻苯二甲醛试剂A液：40 mg邻苯二甲醛（OPA）与1 mL甲醇溶液混合。邻苯二甲醛试剂B液：0.5 g十二烷基硫酸钠与25 mL 0.1 mol/L硼酸溶液混合。在通风台将A液与B液混合于50 mL容量瓶中，加入100 μL β-巯基乙醇，蒸馏水定容得到。

氨基酸标准曲线的测定：称取1.00 g亮氨酸，溶于1 000 mL 蒸馏水中。梯度稀释为 0、50、100、200、300、400、500 mg/L。吸取50 μL各浓度的标准溶液，其中加入1 mL邻苯二甲醛试剂，室温下反应2 min，在吸光度340 nm处测定吸光度，制作标准曲线。依据测得的鱼肉中的吸光度代入标准曲线中计算样品中氨基酸态氮的含量。

1.4 统计分析

试验中所有试验至少重复3次，方差分析及差异显著性分析（p＜0.05）采用SPSS20.0统计分析软件进行分析，图表采用OriginPro 8.5进行绘制。

2 结果与讨论

2.1 菌落总数及腐败微生物菌落数

多数水产品都是由于身体表面或体内的微生物的存在而发生分解，分解到一定程度就变为了腐败。当腐败进行到自溶阶段的后期，由于内源酶的存在，含氮物质的分解逐渐增多，细菌利用这些营养物质繁殖加快，多数国家都会对细菌菌落总数（totalviablecount，TVC）做出规定与划分。细菌总数[10]指的是取1 g或1 mL食品，一定条件处理后培养所得细菌菌落的总数。微生物是引起多数水产品腐败的主要因素之一，腐败微生物的生长状况反映了水产品的腐败程度[11]。由于微生物的作用，鱼体内的蛋白质和氨基酸等物质发生脱氨、脱羧反应或者被分解，而产生氨、胺类（腐胺、尸胺、组胺）、硫化氢以及吲哚类化合物，从而使鱼体产生具有腐败特征的臭味。因此，在贮藏过程中检测鱼肉腐败微生物的动态变化可以很好地反映鱼体的腐败程度[12]。腌制鱼类是通过控制盐分、水分含量、贮藏条件等栅栏因素，抑制产品腐败变质和细菌生长，达到延长产品货架期的目的。为了保证腌制鱼类在食用前的安全性，实时的测定不同贮藏条件下细菌总数的含量变化具有非常重要的现实意义[13]。不同样品的菌落数见图1。

图1 不同样品的菌落数Fig.1 Number of colonies in different samples

由图1可知，4种原料鱼中的菌落总数和假单胞菌菌落数具有显著性差异。原料4中的总菌落数最多，为5.6 log CFU/g；原料2与原料3中的总菌落数无显著性差异，且原料3的菌落数更多，这可能与处理方法有关；原料1鲜鱼中的总菌落数为3.3 log CFU/g，在4种原料中数量最少，这与李婷婷[14]研究的大黄鱼的初始菌落数接近，为2.9 log CFU/g，表明此时鱼品质处于比较好的品质。与TVC值相比，特定腐败菌的数量更能表征水产品的新鲜程度[15]假单胞菌作为腐败菌，占菌落数目的大部分，说明假单胞菌是导致鲅鱼腐败的主要细菌。细菌总数≤106CFU/g为一级鲜度。结果表明4种原料菌落总数均小于106CFU/g，新鲜度为一级。

2.2 挥发性盐基氮（TVB-N）

挥发性盐基氮就是水产品在腐败过程中，在微生物和酶的相互作用下，将鱼肉中的蛋白质被分解生成氨和胺等碱性挥发性的含氮物质。TVB-N与水产品的腐烂存在着良好的相关性。而水产品的腐烂与菌落总数存在着良好的相关性，因而挥发性盐基氮与菌落总数存在着良好的相关性。水产品腐烂的程度越大，挥发性盐基氮的数值就越大，落总数也就越多。因此我们常常将挥发性盐基氮也作为判断水产品是否腐败的重要指标之一。国家卫生标准GB 2733-2015《食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品》规定海水鱼TVBN的临界值通常为不超过30 mg/100 g。不同样品的挥发性盐基氮含量见图2。

图2 不同样品的挥发性盐基氮含量Fig.2 Total volatile basic nitrogen content of different samples

如图2所示，原料1 TVB-N值与其他3种原料具有显著性差异，其中原料4的最高，达到132 mg/100 g，显著高于其他3种原料TVB-N值，远远高于30 mg/100 g，为已降解不可食用的鱼。说明存放较长时间后鱼中蛋白质被降解，鱼体内部氨基酸态氮和可溶性蛋白的浓度增高。原料1TVB-N值最小，为14.7 mg/100 g，小于 15 mg/100 g，为一级品[16]。

原料2和原料3的TVB-N值分别为24.0mg/100g，24.8 mg/100 g，TVB-N＜30 mg/100 g为二级品，无显著性差异。

原料4的TVB-N远远高于30 mg/100 g，而原料1、原料2和原料3符合国家标准。原料4鲅鱼干制作后储藏时间较长，而且本研究发现鱼干中微生物数目也远远大于制作后储藏时间较短的鱼干。鱼肉中的微生物越多，其分解的蛋白质越多，蛋白质分解后产生的挥发性物质即TVB-N就越高。

2.3 pH值

Varlik等[17]指出pH影响自由氢离子和氢氧根离子的浓度，因此pH值的测定是常用的物理质量控制方法。水产品捕捞后，在糖原分解酶的作用下，糖原分解产生有机酸从而导致pH值下降，而后随着微生物的繁殖及在内源酶的作用下，蛋白质分解为小分子胺类物质又使pH值上升[18]。因此，水产品贮藏过程中pH值的变化对水产品的新鲜度的变化也会起到一定程度的指示作用。pH值不同代表着新鲜度也不同，且pH值越大，其腐败程度越大。pH值为5.5～6.8的为新鲜鱼，pH值为6.9～7.0的为次鲜鱼，pH值为7.1以上的为变质鱼。

本试验中4种不同鲅鱼原料测得的pH值如图3所示。

图3 不同样品的pH值Fig.3 pH of different samples

2.4 TBA

TBA值反应的是咸鱼在贮藏过程中脂肪氧化产生的丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量。相同条件下，样品中脂肪含量越高，脂肪氧化程度越大[12]。研究表明，乙醛和辛二酮与脂质氧化产生的刺激味之间有显著的相关性，同时与硫代巴比妥酸法之间有很高的相关性，因此是以TBA评价水产品中脂质氧化的有效方式。TBA值越高，代表鱼肉腐败的程度越大。本试验中4种鲅鱼原料TBA如图4所示。

2.5 酸价

酸价是衡量水产品油脂酸败的重要指标。鱼、虾等水产品在加工、贮藏及运输过程中，由于受氧、水、光、热、酶和微生物等因素的作用，油脂逐渐水解或氧化而变质，使中性脂肪分解为游离脂肪酸而使酸价增高，或使脂肪酸形成过氧化物后再分解为低级脂肪酸、醛类和酮类等有害物质[19-20]，影响水产品中油脂贮藏的稳定性，危害人体健康。因此，测定水产品的酸价有助于判断其油脂水解酸败程度，从而鉴定水产品的品质[7]。

图4 不同样品的硫代巴比妥酸值Fig.4 Thiobarbituric Acid Values for Different Samples

图5 不同样品的酸价Fig.5 Acid values of different samples

从图5可知，原料1、原料2、原料3、原料4的酸价各为 2.11、2.86、3.62、4.84 mg/g，从大到小的顺序仍然为原料4、原料3、原料2、原料1。酸价小于40 mg/g为可食用，具有显著性差异。从酸价这个指标来看，制作后储藏时间短的鲅鱼干与制作后储藏时间长的鲅鱼干都没有变质，均可食用。

酸价从高到低依次为制作后储藏时间较长的鲅鱼干、制作后储藏时间较短的鲅鱼干和新鲜的鲅鱼。数据出现上述问题一定是由于鱼体内微生物的繁殖增多，微生物的作用使得油脂逐渐水解形成游离脂肪酸，从而造成鱼肉的腐败。

2.6 盐分

鲜鱼的水分活度约为0.99，一般来说，体内富含有水的食物往往它们的水分活度会大于0.85。水分活度较高的话，比较适宜细菌的生长和繁殖。因此，要想控制食物中病原体的生长繁殖，一般来说需要冷藏或者采取其他的措施。

盐渍食物不但能够抑制微生物的生长繁殖，而且还能给他们带来新的风味与口感。盐的防腐作用首要就是提升渗透压，从而浓缩细胞质膜而发生质壁分离。不同微生物对食盐浓度的适应性不同，具有差别，因而对盐分进行测定是十分必要的。不同样品中的盐分如图6所示。

图6 不同样品的盐分Fig.6 Salinity of different samples

由图6可知，原料1、原料2、原料3和原料4的盐分分别为2.15%、17.28%、13.35%和10.53%。由此可见，原料2的鱼中盐分含量最大，除了原料1鲜鱼，原料4所含盐分最少。

盐可以起到杀菌的作用，因此盐分越高，食物中的微生物数目越少，分析与试验得出的菌落数目结果相一致。

2.7 水分

鱼肉在解冻过程中存在汁液流失的现象，最终导致鱼肉在空气中氧的作用下脂肪氧化酸败，而且会使表面黄褐变，外观变差，食味、风味、营养下降。水分含量的大量损失包含了大量营养物质的损失，影响食品口感。一定的水分含量可保持食品品质，延长食品保藏。4种原料中的的水分含量如图7所示。含水量具有显著性差异。原料1的水分含量最高，为70.09%，与蔡秋杏等[21]所测得的原料大黄鱼中的水分含量68.28%接近；原料2、原料3、原料4的鲅鱼含水量各为49.81%、52.45%和26.25%。其中原料1水分含量最多，说明在鲜鱼的状态下水分并没有蒸发很多，原料4水分含量低是由于腌制阶段盐的脱水作用风干阶段造成的。

图7 不同样品的水分Fig.7 Moisture of different samples

2.8 氨基酸态氮

本试验选用的标准亮氨酸溶液浓度为0.5 mg/mL，绘制的亮氨酸溶液标准曲线如图8所示。

图8 氨基酸态氮的标准曲线Fig.8 Standard curve of amino acid nitrogen

由图8可知亮氨酸溶液标准曲线方程为y=0.0153x+0.131。

取处理好的样品测定其在340 nm处的吸光度，并带入标准曲线方程中求得游离氨基酸含量如图9所示。

图9 不同样品中的游离氨基酸含量Fig.9 Free amino acid content in different samples

由图9可知原料1、原料2、原料3、原料4中的游离氨基酸含量分别为 0.70、0.99、1.27 mg/mL和2.58 mg/mL，原料1与原料3、原料4具有显著性差异，大小关系仍然为原料4＞原料3＞原料2＞原料1。氨基酸态氮代表的是鱼体内蛋白质的分解程度，游离氨基酸越多，说明鱼肉分解越厉害，即腐败程度越大。原料4腐败程度最大，其次分别为原料3、原料2，最后为原料1。说明，存放时间越长，鱼肉中的微生物越多，鱼肉的腐败程度越大，其中的游离氨基酸态氮越多。

3 结论

原料2、原料3均为制作后储藏时间较短的鲅鱼干，检测之后各项指标均达要求，说明制作后储藏时间较短的鲅鱼干适宜人们食用；原料4为制作后储藏时间较长的鲅鱼干，检测之后有个别指标不达标，比如挥发性盐基氮显著大于标准要求，所以制作后储藏时间较长的鲅鱼干不适宜人们食用。因此，腌渍这种保藏方式是可行的，并且制作后储藏时间较短的鲅鱼干是适宜人们食用的，制作后储藏时间较长的鲅鱼干而不宜食用。