洛阳地区常见嗜尸性麻蝇的COI序列分析

齐锦佩，杨梦姿，赵琳琳，张振辉，朱伟豪，翟仙敦

死亡时间(postmortem interval, PMI)推断一直是司法鉴定的热点和难点，随着法医昆虫学研究的深入，嗜尸性昆虫的生长发育规律可以为PMI的推断提供重要的线索已成为共识[1]，但嗜尸性昆虫的种属鉴定是其广泛应用的瓶颈。其中，双翅目(diptera)与尸体关系最为密切，其分析研究和应用也最多，尤以丽蝇科和麻蝇科发挥重要作用[2-3]。由于麻蝇生长区域广泛、种类繁多，高度相似的形态外观使其仅从外观上难以辨别，相对于丽蝇，麻蝇在尸体不同腐败时期的活动规律不同，其鉴定更加困难[4-5]。因此，对法医学工作者来说，蝇类种属的明确鉴定是一项巨大的挑战。本研究选择用线粒体细胞色素C氧化酶辅酶I(COI) 基因对4种洛阳常见的嗜尸性麻蝇进行序列分析，以期有助于丰富嗜尸性蝇类的基因数据库，为死亡时间的推断提供基础数据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1样本

1.1.1实物样本采集与保存以新鲜猪肝为诱饵，捕蝇笼放置于河南科技大学开元校区树林里，诱捕采集到棕尾别麻蝇、赤尾麻蝇、酱亚麻蝇、急钩亚麻蝇共8只。分类标签置于离心管密封，-20 ℃冰箱保存备用。

1.1.2虚拟样本来源虚拟样本来自GenBank数据库，检索关键词Sarcophaga，以中国地区、COI、动物基因、序列长度为500到18 000为限定条件，经筛选获得与本课题组一致的4种麻蝇共90只，见表1。

表1 GenBank检索数据汇总表

1.2方法

1.2.1样本DNA提取采用本课题组已经建立的嗜尸性蝇类DNA提取方法[6]，用Chelex-蛋白酶K法提取腿部DNA后，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2PCR扩增采用线粒体COI基因通用引物进行PCR扩增。扩增总体系10 μL，内含2×TaKaRa©premix 5 μL，上/下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，DNA模板(含10～20 ng DNA) 1.2 μL，ddH2O补足体系。PCR热循环参数经优化后，采用95 ℃ 1 min；95 ℃ 1 min，45 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.5 min，共5次循环；95 ℃ 50 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 50 s，共35次循环；72 ℃ 10 min。

1.2.3电泳、Sanger测序及序列分析电泳条件：2%琼脂糖凝胶，溴乙锭染色，120 V电压，电泳30 min，采用凝胶成像系统观察并拍照电泳谱带。PCR产物送上海潍捷基贸易有限公司测序，同时采取正反链双向测序以保证序列的准确性。Chromas Version 1.62分析软件查看所获得的8个蝇类样本基因序列，使用MEGA X软件删去首尾信号杂乱序列，在GenBank 中进行在线BLAST 搜索和比对，然后使用邻近法(neighbor-joining,NJ)对序列进行分析，包括：碱基组成分析、计算进化分歧率和构建系统发育树[7]。

2 结果

2.1基因组提取及测序结果本实验获得共8个蝇种样本。PCR扩增片段长度在700 bp上下，经过软件去除杂带和引物后的核苷酸片段长度为648 bp。在线BLAST比对结果显示，所有实验样本与GenBank中已知序列的相似度均>99%，与形态鉴定结果完全一致。见表2。

表2 8个麻蝇样本COI基因序列在线BLAST比对结果

2.2碱基组成差异分析对本研究中98只麻蝇成虫样本的COI基因进行序列分析，结果显示：保守位点526个，可变位点108个。其中简约性信息位点101个，自裔位点7个。碱基平均组成为：A=30.1%，G=16.0%，C=16.7%，T=37.1%，A+T=67.2%，具有明显的A+T倾向性。

2.3发育树分析运用MEGA X软件包对上述98只麻蝇样本线粒体COI基因序列进行分析，以家蝇为外群，构建NJ系统发育树，结果按照不同属、种分别聚类，分子鉴定结果和形态学鉴定结果完全符合。麻蝇属种群聚清晰，在麻蝇种的级别上，自上而下共形成鲜明的4个群聚，分别包括41只棕尾别麻蝇、9只赤尾麻蝇、4只急钩亚麻蝇和44只酱亚麻蝇，支持率均为100%，效果好。

2.4种内及种间进化分歧经计算获得棕尾别麻蝇、赤尾麻蝇、酱亚麻蝇、急钩亚麻蝇共98只不同个体的遗传距离，98只蝇种平均进化分歧率0.06，种间范围0.06～0.10，种内范围0～0.03种间差异和种内差异没有交叉，见图1。

3 讨论

我国的嗜尸性麻蝇分布广泛、种类较多，且其繁殖周期特殊、嗜尸习性独特，因此在死亡时间推断等方面表现出其蝇种优越的法医学价值[6]。

图1 4种麻蝇种间差异和种内差异

本研究共获得棕尾别麻蝇、赤尾麻蝇、酱亚麻蝇、急钩亚麻蝇8个麻蝇，分子鉴定结果与形态鉴定结果一致。洛阳地区的4种嗜尸性麻蝇8条序列与来自GenBank数据库我国不同地区的90个相应蝇种序列合并分析后发现，利用COI基因序列可以有效地将洛阳地区常见嗜尸性麻蝇类鉴定到种的水平。所获基因序列通过BLAST在线比对显示，本研究麻蝇样本与GenBank中的相应蝇种已知序列相似度均>99%。对本研究8个蝇类个体mtDNA上COI基因序列进行分析，在麻蝇科的级别上形成4个种群聚，支持率均为100%，种间划分清晰、效果好；4个蝇种的平均进化分歧率0.06，种间范围0.06～0.10，种内范围0～0.03，种间差异和种内差异没有交叉。

Zhang C等应用COI基因短序列成功对麻蝇科属种进行鉴定，取得较好的效果，本研究结果与其一致[8-9]。Jordaens等对麻蝇科蝇种的COI全序列进行鉴定分析，证实COI全序列虽具有较高的鉴别效力[10]，但多态性好的仍为COI的经典序列区域，本研究结果再次证实该区域的良好多态性。虽然有不少研究指出，同种不同地区个体的一些基因差异较大，提示可以利用该差异进行死亡地点的推测[11-12]。本研究共分析15个城市的样本，结果显示差异不大，即使样本量较大的棕尾别麻蝇和酱亚麻蝇也无明显差异，这提示COI基因序列对所涉及的4种麻蝇的不能区分其归属地。

总之，本实验表明线粒体COI(648 bp)序列能很好地对洛阳地区常见的4种嗜尸性麻蝇种类进行分析鉴定，所获得的基因序列同时也是嗜尸性蝇类分子鉴定基因库的有益补充。