α地中海贫血筛查及诊断技术的进展

沈茹 陈云明 杨晓红 王晓岩

α地中海贫血（α-thalassemia）是因α珠蛋白基因变异，导致α珠蛋白缺乏或合成水平降低，以溶血、不同程度的小细胞低色素性贫血为表现的一种血红蛋白病（hemoglobinopathy）。α珠蛋白可构成胎儿期及成年期最重要的3种血红蛋白：血红蛋白F（hemoglobin F，HbF）、血红蛋白A（hemoglobin A，HbA）、血红蛋白A2（hemoglobin A2，HbA2），正常人的2个α珠蛋白基因（αα/αα）分别从父、母两方继承。当前已发现超过100种与α地中海贫血相关基因型［1-2］，我国最为常见类型为东南亚缺失型α地中海贫血--SEA、右侧缺失-α3.7、左侧缺失-α4.2、非缺失型的血红蛋白Constant-Spring（hemoglobin Constant-Spring，HbCS）和血红蛋白 Quong-Sze（hemoglobin Quong-Sze，HbQS）［3］。α 地中海贫血患者的临床表现根据基因型和变异数目不同而有所差异，从无症状携带到宫内即死亡均可见，主要症状为贫血、肝脾肿大、黄疸等。地中海贫血主要发病地区集中于热带和亚热带，特别是地中海沿岸，我国发病率较高省份为广西、广东、云南，海南等省［4］。临床上，对α地中海贫血的治疗主要集中在对症治疗和对因治疗，主要是输血和干细胞移植两方面，治疗带来的花费大、并发症多。因此，对特定人群的筛查、检测，对于α地中海贫血的防控尤为重要，而实验室诊断技术的进步意义重大。本文分析和总结了近年来国内外在α地中海贫血筛查及诊断方面的研究进展，进行简要的综述，以期加深对不同的实验筛查、诊断技术及发展的了解，为各种技术方法的应用和改进拓宽视野和思路。

1 α地中海贫血的分子生物学机制

正常成年人血红蛋白（HbA）的构成主要为2条α珠蛋白链和2条β珠蛋白链（α2β2），胎儿血红蛋白（HbF）由2条α珠蛋白链和2条γ珠蛋白链（α2γ2）构成，编码α链和γ链的基因2条来自父源、2条来自母源（αα/αα，γγ/γγ），编码β链的基因则1条来自父源、1条来自母源（β/β）［5］。在胎儿及成人中，若α链在血红蛋白中的含量降低，则β链或γ链的比例升高，而β链或γ链比例升高的血红蛋白氧气亲和力高于正常的血红蛋白，导致在外周毛细血管无法正常地将氧气解离，进而导致以缺氧为主要病理机制的一系列临床症状［6］。

编码α珠蛋白的基因位于16号染色体短臂末端临近端粒13.3处，该区域包括2个α基因（α1、α2）、1个胚胎期基因ζ2、3个假基因及1个功能未知的基因。根据α链基因缺陷程度，分子生物学上将α地中海贫血分为2类：一类为缺失型α地中海贫血，由较大片段基因缺失导致；另一类为非缺失型α地中海贫血，由少数核苷酸插入、缺失、单个替换而导致。而在个体层面上，又可以分为2类：①α0地中海贫血，因缺失2个α基因（--/αα）导致α珠蛋白合成完全受阻所致，我国常见基因型为--SEA，而--THAI及--FIL较为罕见；②α+地中海贫血，由点突变导致的基因缺失或失活（-α/αα或ααND/αα），从而使部分α珠蛋白合成受阻，我国最常见的α+地中海贫血基因型为-α3.7、-α4.2缺失型突变以及HbCS、HbQS、血红蛋白 Westmead（hemoglobin Westmead，HbWS）点突变［7］。临床上一般根据α基因变异数目分为：静止型（1个α基因异常）、标准型（2个α基因异常）、HbH病（3个α基因异常）、Hb Bart胎儿水肿综合征（4个α基因异常）［8］。静止型为无症状携带者；标准型和HbH病可因突变位置、类型、严重程度不同，出现贫血、肝脾肿大等一系列症状；Hb Bart最为严重，大多在孕中晚期流产或出生后短时间死亡，少数可在宫内输血、出生后输血等方式下出生并生存至5岁左右，但生存质量和预后极差。

2 α地中海贫血常用的诊断方法

2.1 筛查方法

临床上高度怀疑为α地中海贫血的患者，常规的筛查检测包括血常规检查、红细胞形态学检查、红细胞渗透脆性实验、不稳定血红蛋白测定、血红蛋白电泳等手段。在实际临床中，考虑到敏感性、特异性，常用的筛查方法为血常规检查和血红蛋白电泳2种［9］。

2.1.1 血常规检查

在临床实践中，血常规通常是贫血类疾病首选及基础检验技术。α地中海贫血细胞学表现为小细胞低色素性贫血，所以，如果血常规显示MCV＜80 fL，MCH ＜ 27 pg［8］，即可诊断为小细胞低色素性贫血，而进一步确诊地中海贫血需与其他小细胞低色素性贫血如缺铁性贫血、儿童铅中毒、铁幼粒细胞贫血等疾病相鉴别。红细胞计数在地中海贫血患者及携带者中通常有一定程度的增高，网织红细胞通常偏低，可以此进行初步鉴别［10］。考虑到血常规检查的经济性，利用其作为初筛手段，具有重要的实用意义。

2.1.2 血红蛋白电泳

对于 MCV＜80 fL，MCH＜27 pg的小细胞低色素性贫血，在进行鉴别后如高度怀疑地中海贫血，可进行血红蛋白电泳进行分析。在基因诊断广泛应用之前，血红蛋白电泳首次在19世纪70年代被用于产前诊断，并被作为地中海贫血的确诊实验长达30余年［11］。常用的实验室技术有：血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳、珠蛋白肽链聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）、全自动毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE）、全自动琼脂糖电泳等。其中全自动琼脂糖电泳为曾经广泛应用的技术，其原理是根据各种不同类型的血红蛋白分子携带的电荷不同、在电场中运动速度不同，而分离不同类型的血红蛋白。在电泳后，经染色、脱色、固定，用扫描仪扫描电泳图像，对各条电泳带进行定量分析，可测定HbA、HbA2、HbF、血红蛋白H（hemoglobin H，HbH）、血红蛋白 Bart（hemoglobin Bart，Hb Bart）以及其他异常的血红蛋白的含量［12］。血红蛋白电泳技术，可直接确诊Hb Bart型α地中海贫血，其余类型均因血红蛋白含量有限或不稳定，难以直接观察，无法直接诊断。但其对于β地中海贫血具有明确诊断意义，故可以作为排除性诊断的重要手段［13］。随着分子生物学诊断方法进步与发展，血红蛋白电泳逐渐被基因诊断所替代，基因诊断现已成为最广泛使用的确诊实验方法。但在缺乏相应实验室条件，或在复杂、非典型突变类型的诊断中，依然具有重要地位［14］。

2.2 分子生物学诊断方法

2.2.1 缺失型α地中海贫血的基因诊断

2.2.1.1 Southern印记杂交 Southern印记杂交原理为：首先用限制性内切酶消化提取出的目的DNA；再经琼脂糖凝胶电泳取得DNA片段后，分离不同DNA片段至硝酸纤维膜上；用放射性同位素标记的DNA或RNA探针与酶切、分离后的DNA片段杂交；最后用同位素显影技术，显示不同酶切后的DNA片段的位置及其大小。该检测技术可作为α珠蛋白基因片段缺失的诊断金标准，因而可用作其他检测手段的最终确诊试验［15］。该方法缺点为操作繁琐，费时费力，不利于大范围开展，因此限制了其临床诊断中的应用。然而该检测结果稳定可靠，可作为PCR诊断结果的确诊实验。

2.2.1.2 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（reverse transcription quantitative，real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR） RT-qPCR 其原理为采用荧光染色检测聚合酶链式扩增后产物总量［16］。采用该方法检测时，可用不同颜色的荧光素对PCR扩增出的产物进行标记，从而同时显示不同片段的扩增产物，可分辨正常基因型、杂合子和纯合子［17］。该方法为目前确定样品PCR产物总量最敏感、最特异的方法。Fallah等人［18］应用RT-PCR技术，对29例经缺失基因测序后记过为阴性的疑似α地中海贫血患者的样本进行了检测，其结果显示29例样本中均存在α珠蛋白基因缺失。

2.2.1.3 跨越断裂点聚合酶链反应（Gap-polymerase chain reaction，Gap-PCR） Gap-PCR最早由中国台湾学者Chong等［19］建立，其原理为：设计2对或1对和1个单独的引物，1对引物与缺失区域外侧的基因序列互补，另1对或另1个单独的引物与缺失区域内的基因序列互补。若是正常基因型或杂合子，在缺失区域内的引物能够扩增出片段；若是纯合子，则缺失区域内的引物不能扩增出片段。而在缺失区域外侧的1对引物，因缺失的基因使两端DNA拉近，进而扩增成DNA片段［20］。该方法可鉴别出纯合子患者、杂合子携带者和正常人。目前通过该手段可鉴别诊断8种以上常见的α地中海贫血基因［21］，且该技术容易开展，检测过程简单，需时短，成本低，便于临床推广，可广泛应用于缺失型α地中海贫血的基因检测。但该手段的缺点为仅可检测出已知突变，如存在未知的突变则会出现假阴性结果，干扰临床诊断［22］。

2.2.1.4 多重连接探针扩增技术（multiplex ligationdependent probe amplification，MLPA） MLPA技术是对样品中的目标序列定位和定量的检测技术，该技术联合基因杂交、连接酶催化反应、PCR扩增反应等技术，可以同时检测40多个不同核酸序列拷贝数的变化。在MLPA技术中，先设计2个寡核苷酸探针，与靶序列进行杂交，之后利用连接酶的特性将两部分探针连接。基于连接反应具备高度的特异性，即仅当2个探针均与靶序列完全互补杂交，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核苷酸链。如存在一个碱基的差别，都可以导致杂交不完全，连接反应因此无法进行。连接反应完成后，用适当引物扩增，之后使用毛细管电泳分离产物，进行软件分析，根据图像中扩增峰与标准扩增峰的对比，根据扩增峰改变情况判断是否有突变存在［23］。Joly 等［24］运用 MLPA，发现了一种长达285 kb的包含整个α珠蛋白基因家族的大片段缺失的缺失型α地中海贫血。Phylipsen等［25］亦应用该技术，检测出了11种新的缺失型α地中海贫血基因。该方法存在成本较高，且需要毛细管电泳仪等缺点，不便于推广应用。由于可以检测出基因类型未知的α地中海贫血，MLPA可以作为常见方法检测阴性但高度怀疑地中海贫血时的确诊实验。

2.2.2 非缺失型α地中海贫血的基因诊断

2.2.2.1 反向点杂交聚合酶链反应（polymerase chain reaction-reverse dot blot，PCR-RDB） PCRRDB为临床上广泛应用的检测技术，其原理采取在尼龙膜上固定已知的寡核苷酸探针序列，与PCR产物进行杂交，后经分析杂交信号可检测出标本的突变情况［26］。该方法优点为一份标本中如存在多种点突变可同时检测出，郭广洲等［27］应用该检测技术针对中国人常见的3种非缺失型α地中海贫血（αQSα，αCSα，αWSα）展开实验，明确检测出同一样品在3个位置发生的点突变，并区分了纯合子或杂合子突变，证实了该检测方法简单高效，符合临床检验需求。

2.2.2.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP） PCR-RFLP原理为经混合DNA限制性内切酶与PCR产物，利用内切酶高度识别切割特定DNA序列的特性，酶切得到不同DNA片段［28］。点突变型α地中海贫血将导致DNA序列改变使酶切位点改变，从而影响酶切片段的长度。通过凝胶电泳可鉴别DNA片段的数量及大小，与正常序列酶切片段电泳对比，据此判断标本是否存在点突变［29］。该法虽操作简便，用时短，但因其不能检测出具体点突变类型，限制了该技术在临床上的推广应用。

2.2.2.3 基因芯片（gene chip） 基因芯片技术在80年代被提出，后于90年代该技术开始用于诊断地中海贫血。该技术原理是已知序列的靶核苷酸探针（基因探针）排列固定于硅片、玻片等支持物上，与经过荧光或同位素标记的样品进行杂交，以芯片上不同位置出现的杂交信号的有无及强弱为标准进行样品突变的定性及定量分析。Ye等［30］通过在实验中计了常见的α、β地中海贫血基因的38个探针（其中包括地中海贫血的常见16种突变，-α3.7、-α4.2、--SEA、αQSα、αCSα），可在同一杂交反应，即于一块芯片中检测出这些突变的存在与否，极大地简化了实验步骤，使地中海贫血在基因芯片检测技术方面得到了极大的提升。该检测具有快速，高效，高敏感性及高效性等特性，为临床的α地中海贫血检测提供了一种新型、快速的检测手段。

2.2.2.4 DNA序列测定 DNA序列测定是基于一定手段测定标本基因核苷酸序列，从而检测出准确点突变的位置及类型，是目前检测基因突变的金标准［31］。该方法是利用DNA自动测序仪对标本的PCR产物进行全自动化核苷酸序列测定，得出该标本核苷酸序列，进而分析取得点突变位置及类型。Galehdari等［32］采用RDB-DNA测序联合技术对伊朗的1 241例标本进行检测，发现42种基因突变，高于PCR-RDB能发现的17种突变。目前该检测技术优点在于不仅可以检测出已知突变，在一定程度上亦可检测出未知突变［33］。DNA序列测定具有快速高效，结果准确等特性，若今后出现可降低成本的技术改进，则该技术在临床检测方面的推广前景会进一步增加。

3 小结与展望

随着现代检验科学技术的不断发展，α地中海贫血的实验室诊断技术也在不断改进及提高，各种先进的分子生物学科研成果正不断转化为可行的实验室诊断技术。在众多技术手段中，如何精准选择合适的方法，需要检验工作者结合疾病本身的特点、实验室设备状况以及当地经济水平等条件，在综合分析后进行选择。在所有的地中海贫血分型中，血常规、血红蛋白电泳作为最基础的筛查手段，对于疾病的初步鉴别诊断具有重要意义，是不可或缺的诊断手段。而进一步的确诊实验，则要根据相关指南，用2种不同原理的方法进行确诊。考虑到我国α地中海贫血以缺失突变为主的情况，可优先选用RT-qPCR以及Gap-PCR技术。若为阴性结果，则考虑进行非缺失型突变相关的PCR-RDB、基因芯片、DNA测序等方法。对于实验室检测阴性但临床高度怀疑的病例，则需要考虑未知突变、非典型突变的可能，应当根据实验室条件不同，尝试进行MLPA和DNA测序、PCRRFLP、Southern blot等实验。考虑到MLPA、RCRRFLP、DNA测序技术现阶段成本较高，Southern blot在基层实验室开展困难等特点，临床实践中亦可将样本送至有条件的实验室协助诊断。同时，应当不断追踪国际国内最新的技术进展，以期将科研成果及时转化为实用的技术，提高诊断方法的敏感性和准确性，同时尽可能降低成本，为患者及临床医生提供更加可靠的实验室诊断方法。