乌鲁木齐地区维吾尔族ORMDL3基因单核苷酸多态位点与哮喘易感性的研究

王玲 魏研荣 王丽霞 张艳丽 王晶

支气管哮喘（简称哮喘）是一种气道慢性炎症性疾病，已成为严重危害人民健康的重要的慢性气道疾病之一［1］。目前全球约有超过3亿哮喘患者，不同国家哮喘总体患病率为1%～8%［2-3］。我国14岁以上人群哮喘患病率为1.24%［4］。由于新疆特殊的地理环境，以及新疆维吾尔族饮食习惯、气候、居住条件等的特殊性，使得新疆成为我国哮喘的高发地区之一。研究表明，不同地域、不同民族哮喘的易感基因不同，但大多分布在17号染色体上［5］。全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS）表明血清类黏蛋白1样蛋白3（orosomucoid1-like protein3，ORMDL3）是迄今发现与儿童哮喘关联证据最充分的基因［6］。ORMDL3基因s7216389位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）是哮喘最显著的相关标记［7］，与香港、南方和内蒙古等地区人群哮喘易感性相关［8-9］。目前，新疆维吾尔族人群哮喘与ORMDL3基因多态性的关系尚未见报道。本研究以乌鲁木齐地区维吾尔族人群为研究对象，探讨ORMDL3基因rs7216389、rs12603332位点多态性与维吾尔族哮喘易感性的关系，旨在从分子生物学角度探讨哮喘在乌鲁木齐地区维吾尔族人群中的遗传机制，为临床诊断及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2015年1月至2016年12月新疆医科大学附属中医医院门诊及住院确诊的维吾尔族哮喘患者（祖籍三代无血缘关系、无异族通婚史）100例，设为哮喘组，男27例，女73例，年龄18～70岁，平均年龄（54.3±12.9）岁；收集同期体检的维吾尔族健康人93例为对照组，男30例，女63例，年龄18～70岁，平均年龄（45.6±17.0）岁。2组在年龄及性别上差异无统计学意义，且均来自新疆乌鲁木齐地区。纳入标准［4］：（1）典型哮喘的临床症状和体征：①反复发作喘息、气急，伴或不伴胸闷或咳嗽，夜间及晨间多发，常与接触变应原、冷空气、物理、化学性刺激以及上呼吸道感染、运动等有关；②发作时双肺可闻及散在或弥漫性哮鸣音，呼气相延长；③上述症状和体征可经治疗缓解或自行缓解。（2）可变气流受限的客观检查：①支气管舒张试验阳性；②支气管激发试验阳性；③呼气流量峰值（peak expiratory flow，PEF）平均每日昼夜变异率＞10%或PEF周变异率＞20%。符合上述症状和体征，同时具备气流受限客观检查中的任一条，并除外其他疾病所引起的喘息、气急、胸闷及咳嗽，可诊断为哮喘。排除标准：①合并气胸、肺癌、肺结核等其他严重肺部疾病者；②合并严重心脑血管、肝肾和造血系统等原发性疾病者；③精神病患者；④妊娠及哺乳期妇女；⑤3个月内使用全身糖皮质激素者；⑥吸烟患者。本研究经医院医学伦理学委员会批准，患者知情同意。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要仪器

多用电泳仪电源（BG-Power3500，北京百晶生物技术有限公司），凝胶成像仪（Tanon-3500R，上海天能科技有限公司），PCR仪（EDC-810，北京东胜创新生物科技有限公司），紫外分析装置（FR-110，上海复日科技有限公司），测序仪（ABI3730XL，美国ABI）等。

1.2.2 主要试剂

HotStar HiFidelity Polymerase Kit（202605，Qiagen 德国），DL2000 DNA Marker（DL2501，上海捷瑞生物工程有限公司），琼脂糖（AB0013-250g，上海捷瑞生物工程有限公司），溴化乙啶（EB0195-25 g，上海捷瑞生物工程有限公司），FastAP酶（Fermentas，加拿大），外切酶 I（EXO-I）（Fermentas，加拿大），Hi-Di™ Formamide（4311320，ABI，美国），SNaPshot®MultiplexKit（4323161，ABI，美国），GeneScanTM-120 GeneScan（4324287，ABI，美国）等。

1.3 研究方法

1.3.1 DNA的提取

采集维吾尔族哮喘患者及健康人空腹静脉血5 mL，EDTA-Na2抗凝，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，样本置-80℃保存。

1.3.2 基因多态性检测

使用SNaPshot技术，毛细管电泳检测，在美国ABl3730xl型全自动DNA测序仪上进行测序，ORMDL3基因rs7216389、rs12603332位点单核苷酸多态性的基因分型应用GeneMapper 4.1（AppliedBiosystems Co.Ltd.，美国）分析。

1.3.2.1 SNP位点引物设计 使用Primer Premier 5设计SNP位点附近上下游引物，rs7216389上游引物序列：CCTGCCTCCAAAACCTAGCA，下游引物序列：GCAGTTCTGTCGCTGTTGTT；rs12603332上游引物序列：GCTGGGCCCG-GATATTTGTA，下游引物序列：AGAGAGAAGAGGCTGGCAGA。

1.3.2.2 DNA样本质检 DNA样本取1 μL，1%琼脂糖凝胶电泳对其样本进行质检，用核酸蛋白定量仪测定DNA浓度以及260/280；然后根据测定的浓度将样本稀释到工作浓度5～10 ng/μL。

1.3.2.3 多重PCR反应 ①多重PCR引物中各引物的终浓度为1 μmol/L；②PCR反应体系如下：DNA 1 μL，10×buffer 1.5 μL，MgCL2（25 mmol）1.5 μL，dNTP（10 mmol）0.3 μL，引物（10 μmol）0.15/条，Taq 酶（5 U/μL）0.3 μL，ddH2O 补足到 15 μL；③多重PCR反应采用Touch-down的PCR反应程序如下：94℃预变性 3 min；（94℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s）-0.5℃/循环，11 个循环；94℃ 15 s，54℃15 s，72℃ 30 s，24个循环；72℃延伸3 min。

1.3.2.4 PCR产物纯化 PCR扩增后取3 μL PCR产物用ExoI和FastAP纯化，主要是用ExoI去除反应产物中的剩余引物，用FastAP去除反应中剩余的dNTP。反应体系如下：PCR产物3 μL，ExoI（20 U/μL）0.2 μL，FastAP（1 U/μL）0.8 μL，ExoI buffer 0.7 μL，ddH2O 补足到7.0 μL。37℃ 15 min，80℃ 15 min，纯化好后进行延伸反应，预先混好延伸引物。

1.3.2.5 SNaPshot多重单碱基延伸反应 使用Primer Premier 5设计SNP位点附近上下游引物进行SNaPshot多重单碱基延伸反应：①rs7216389延伸引物：TTTTTTGATCAATCAGGGCCGAGTCCATGC，rs12603332延伸引物：TTTTTTTTTACCCAGGGAGCCTTCTCTGACAG；②延伸反应体系：PCR产物2 μL，SNaPshot Mix 1 μL，延伸引物（10 μmol）0.2/条，ddH2O 补足到6.0 μL；③PCR循环程序如下：96℃ 预变性1 min；（96℃ 10 s，52℃ 5 s，60℃ 30 s），30个循环。

1.3.2.6 延伸产物测序 上ABI3730XL测序仪测序样本的制备，体系如下：Hi-Di™Formamide 9.0 μL，纯化后的延伸产物1 μL，总体积10.0 μL。将各组分混匀，95℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪。

1.3.2.7 原始数据分析 ABI3730XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper4.1分析。

1.3.3 统计学方法

利用SPSS 17.0软件进行分析。数值变量资料均进行正态性检验和独立样本t检验，分类变量资料组间比较采用χ2检验。各研究对象年龄以（±s）表示，基因型频率及等位基因频率用百分数表示，各基因型和等位基因频率的差异性用χ2检验，对照组与哮喘组基因型均进行Hardy-Weinberg平衡定律检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 基因组DNA质检电泳图Figure 1 Genomic DNA quality control electrophoretogram

2 结果

图2 rs7216389位点基因分型毛细管电泳峰Figure 2 Allele peaks of rs7216389 genotyped by capillary electmphoresis

图3 rs12603332位点基因分型毛细管电泳峰Figure 3 Allele peaks of rs12603332 genotyped by capillary electmphoresis

ORMDL3基因 rs7216389、rs12603332位点基因分型结果，见图1～图3，检测结果显示在哮喘组的实际情况中，2个SNP位点中AA、AG和GG基因型分别为61（32.8%）、63（33.9%）和62（33.3%）例，A和G等位基因在该人群中的分布频率分别为49.8%和50.2%。Hardy-weiberg遗传平衡检验结果表明数据均符合Hardy-weiberg定律（P＞0.05）。由表1可知，与对照组相比，哮喘组ORMDL3基因rs7216389和rs12603332位点的优势等位基因与劣势等位基因的差异存在统计学意义（P＜0.05）。

表1 哮喘组与对照组rs7216389和rs12603332位点基因型和等位基因频率Table 1 The frequencies of genotype and allele of rs7216389 and rs12603332 between the case and the control groups

3 讨论

哮喘是一种复杂的疾病，其发病涉及到遗传和环境因素之间的相互影响，其中遗传因素占48%～79%不等［10］。哮喘可有明显的家族聚集性，不同人种、民族、人群在疾病的易感性和抵抗性方面表现出一定的差异［11］。对于哮喘遗传风险因素被证明因不同群体而不同［12］。ORMDL3基因rs7216389位点与儿童哮喘存在较强的关联［13］。刘丽红等［14］通过 Meta分析发现，ORMDL3 基因rs7216389多态性与中国人儿童和成人哮喘发病均密切相关。本研究选择ORMDL3基因rs7216389位点进行多态性分析，结果发现哮喘组中3种基因型（AA/AG/GG）分别为57.0%、34.4%、8.6%，对不同基因型观测值和期望值用χ2检验检测，差异有统计学意义（χ2=7.092，P＜0.05）。说明ORMDL3基因多态性是新疆乌鲁木齐地区维吾尔族成人哮喘发病的危险因素。ORMDL3基因rs12603332位点也是研究与哮喘相关较多的一个位点。Sabar等［15］发现rs12603332在巴基斯坦及非裔美洲人群中同哮喘显著关联。本研究表明ORMDL3基因rs12603332位点与维吾尔族哮喘的发病水平最为相关。哮喘组中3种基因型（GG/GA/AA）分别为58.1%、33.3%、8.6%，不同基因型χ2检验，差异有统计学意义（χ2=11.367，P＜0.01）。我们的研究还发现ORMDL3基因rs12603332位点和rs7216389位点基因型在维吾尔族群体中均符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示我们纳入研究的人群具有良好的群体代表性。

观察哮喘组和对照组ORMDL3基因rs7216389位点基因型发现，哮喘组AA型纯合子明显高于对照组，表明AA基因型与乌鲁木齐维吾尔族哮喘相关联，而哮喘组GG型例数低于对照组，等位基因A与G的频率分布在哮喘组频率分别为74.2%和25.8%，而在对照组为61.5%和38.5%，表明rs7216389位点A等位基因可能是哮喘的危险基因。同样，哮喘组的ORMDL3基因rs12603332位点GG型纯合子高于对照组，而AA型纯合子低于对照组，等位基因G与A的频率分布在哮喘组频率分别为74.7%和25.3%，而在对照组为58.5%和41.5%，表明rs12603332位点G等位基因可能是哮喘的危险基因，而A等位基因可能是哮喘的保护基因。Wu等［16］对患儿及家长全基因组关联分析，结果显示携带优势等位基因的儿童患哮喘风险明显增加，这与我们的研究结果一致。我们通过对新疆乌鲁木齐地区维吾尔族人群ORMDL3基因rs12603332和rs7216389位点的多态性研究发现，ORMDL3基因单核苷酸位点多态性和新疆成人哮喘发病均密切相关。但一定条件下地理和环境因素差异将影响ORMDL3基因表达情况，故本研究还存在不足之处，将来需要扩大样本量，通过对新疆不同地区和民族的协同研究与分析，进一步阐明其在哮喘发病中的作用，为本地区哮喘的防治提供有效途径。

ORMDL3基因的多态性存在于乌鲁木齐地区维吾尔族人群中，且分布频率有显著性。rs7216389位点AA基因型和rs12603332位点的GG基因型可能是哮喘的危险基因型。本研究不仅增加了少数民族的遗传资源库资源，还为今后不同民族该位点与哮喘的致病机制研究提供了遗传学依据。