弥漫性大B细胞淋巴瘤组织NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表达及意义

王静 李馨筱 吴琳娜 刘凡

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）作为一种常见的淋巴瘤，具有侵袭力强、恶性程度高等特点［1］。有统计数据表明，经联合化疗治疗，40%左右的患者可达到完全缓解，但仍有50%以上的患者对化疗不敏感［2］。目前在癌症研究中发现，癌细胞凋亡对于肿瘤形成与发展起到了重要作用，许多药物均通过诱导癌细胞凋亡而发挥抗癌作用［3］。凋亡过程的调节涉及多组基因，这些调控基因表达改变会对细胞凋亡产生影响，最终引起细胞异常增殖、凋亡受到抑制，进而对化疗产生耐受性，预后不佳［4］。所以对DLBCL细胞凋亡相关基因表达进行检测可作为指导个体化治疗、预测治疗疗效的主要方法之一。NF-κB是一种多向性核转录调节因子，P50/P65二聚体是其最常见形式，NF-κB激活入核后可调节炎症介质、细胞因子等表达。近年来，有研究发现NF-κB还可调节某些细胞增殖基因和抗凋亡基因的表达，可能是肿瘤发病机制中的关键因子［5］。Bcl-2是抗凋亡蛋白，在一些肿瘤细胞中高表达，延长肿瘤细胞存活时间，促进肿瘤发展［6］。Bax是促凋亡蛋白，可抑制Bcl-2的抗凋亡作用［7］。本研究对 NF-κB/p65、Bcl-2 和 Bax 等细胞凋亡相关蛋白表达进行检测，探讨这些蛋白与DLBCL临床病理参数以及预后的关系，为寻找DLBCL新治疗靶点提供参考。

1 材料与方法

1.1 样本收集

组织标本来自于2012年3月至2015年2月我院接受手术治疗的78例DLBCL患者和30例反应增生性淋巴结患者，分别作为DLBCL组和反应增生性淋巴结组。DLBCL组中，男46例，女32例，年龄26～77岁，中位年龄54岁，根据Ann Arbor分期标准［8］，Ⅰ、Ⅱ分期共 51例，Ⅲ、Ⅳ分期共 27 例，淋巴瘤国际预后指数（international prognostic index，IPI）＜2分的38例，≥2分的40例。反应增生性淋巴结组中，男19例，女11例，年龄27～75岁，中位年龄51岁，2组性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。2组患者均经手术、组织病理学证实，术前未接受相关治疗，患者对本研究均知情同意。组织标本的获取和使用均获得本院伦理委员会批准同意。

1.2 主要试剂

兔抗人NF-κB/p65单克隆抗体（ZA-0210）、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体（ZM-0010）、鼠抗人Bax单克隆抗体（MAB-0254）、即用型免疫组化超敏UltraSensitiveTMSP检测试剂盒（KIT-9710）均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 免疫组化方法

石蜡切片厚度 4 μm，3%H2O2处理 10 min。0.01 mol/L磷酸缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）调pH值至7.2～7.4，冲洗干净后，采用水浴锅加热0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）至95℃，放入组织切片热修复15 min。一抗低温封闭过夜，PBS冲洗3次，二抗室温孵育30 min。PBS冲洗5次，DAB显色后采用苏木素复染。经脱水、透明、封片后镜检观察。结果判定：随机选取5个视野，根据阳性细胞所占比例及染色强度评分，无阳性细胞为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为3分；无着色为0分，着色浅黄为1分，着色黄色为2分，着色棕黄为3分，2项评分乘积在3分以上者为阳性［9］。由另2名高年资病理医师观察切片，判定结果，意见不一致时，共同商讨得出最终结果。统计NF-κB/p65、Bcl-2和Bax阳性表达的DLBCL组织中患者的年龄、性别、B症状、IPI得分、结外病灶数、临床分期情况，并进行统计学分析。

1.4 随访

对所有患者随访5～53个月，随访以门诊或电话方式进行，随访内容包括患者生活质量、一般情况、近期复查情况等。

1.5 统计学分析

数据均采用SPSS 21.0软件进行分析，DLBCL组织中NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表达与临床病理参数间的关系行χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析，生存分析采用Kaplan-Meier分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DLBCL组和反应增生性淋巴结组NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表达情况比较

NF-κB/p65主要表达于细胞核，Bcl-2主要表达于细胞浆和细胞膜（图1）。2组NF-κB/p65、Bcl-2和Bax阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 DLBCL组织NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表达与B症状、IPI得分、临床分期等的关系

DLBCL组织NF-κB/p65阳性表达与B症状、IPI得分、临床分期有关（P＜0.05），Bcl-2阳性表达与IPI得分、临床分期有关（P＜0.05），Bax阳性表达与临床分期有关（P＜0.05），见表2。

2.3 DLBCL组织中NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表达之间的相关性分析

免疫组化结果中，NF-κB/p65与Bcl-2表达呈正相关（r=0.53，P＜0.05），NF-κB/p65与Bax表达呈负相关（r=-0.51，P＜0.05），Bcl-2与Bax表达呈负相关（r=-0.62，P＜0.05）。

图1 各蛋白在DLBCL组织中表达情况Figure 1 Expression of each protein in DLBCL tissue

表1 DLBCL组和反应增生性淋巴结组NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表达情况比较［n（%）］Table 1 Comparison of NF-κB/p65，Bcl-2 and Bax expression between DLBCL group and reactive proliferative lymph nodes group［n（%）］

2.4 DLBCL组织中NF-κB/p65、Bcl-2和Bax蛋白表达与生存期的关系

对本研究78例患者随访5～53个月，NF-κB/p65阳性表达中位生存期18个月，NF-κB/p65阴性表达中位生存期34个月，Bcl-2阳性表达中位生存期16个月，Bcl-2阴性表达中位生存期31个月，Bax阳性表达中位生存期30个月，Bax阴性表达中位生存期15个月。Kaplan-Meier生存曲线分别见图2至图4。NF-κB/p65、Bcl-2和 Bax阳性表达与阴性表达的Kaplan-Meier生存曲线有明显差异（P＜0.05）。

表2 DLBCL组织NF-κB/p65、Bcl-2和Bax表达与病理特征关系Table 2 Relationship between expression of NF-κB/p65，Bcl-2，Bax in DLBCL tissue and pathological features

图2 NF-κB/p65阳性表达对DLBCL患者生存期的影响Figure 2 The influence of positive expression of NF-κB/p65 on the survival of patients with DLBCL

图3 Bcl-2阳性表达对DLBCL患者生存期的影响Figure 3 Influence of positive expression of Bcl-2 on survival of patients with DLBCL

图4 Bax阳性表达对DLBCL患者生存期的影响Figure 4 Influence of positive Bax expression on survival of DLBCL patients

3 讨论

DLBCL的发生发展与多种遗传信息异常有关，是一个异质性、多步骤的过程，由各种信号通路的异常激活或阻滞引起的异常细胞生长、分化、凋亡均会引发DLBCL［10-12］。现已明确药物化疗的主要机制是诱导癌细胞凋亡，调节凋亡的基因组包括NF-κB家族、BCL-2家族、胱冬蛋白酶（caspase）家族、TNF 受体家族、MYC 家族等［13］。这些调控基因表达改变会对细胞凋亡产生影响，最终引起细胞异常增殖、凋亡受到抑制，进而对化疗产生耐受性，预后不佳。

p50/p56二聚复合物是NF-κB家族蛋白成员中最常见的活性形式，通常情况下，NF-κB与IκB结合处于未激活状态，当NF-κB受到外界刺激后，IκB被磷酸化降解，NF-κB由从细胞质转移至细胞核，结合靶基因，使转录增加［14］。凋亡调节相关编码基因即为NF-κB靶基因之一，其可通过直接调控凋亡基因调节细胞凋亡，另外还可通过调节细胞周期和其他蛋白互相作用间接调节凋亡［15］。Bcl-2和Bax均属于Bcl-2家族蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白，Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2或Bax基因突变或表达异常均会影响DLBCL治疗疗效［16］。朱斌等人［17］发现 DLBCL 组织中 NF-κB/p65 阳性表达率为62.8%，明显高于淋巴增生组织的23.3%，与IPI评分以及临床分期相关。孟亚红等人［18］研究发现，淋巴瘤组Bcl-2阳性表达率为55.2%，显著高于对照组的25.0%，且与临床分期相关。本研究结果发现，DLBCL组织样本中，NF-κB/p65、Bcl-2阳性率分别为39.74%、51.28%，显著高于反应增生性淋巴结组织样本中的阳性表达率，与上述研究结果基本一致。不同之处在于NF-κB/p65阳性表达除了与IPI得分、临床分期有关，还与B症状有关。国内关于Bax在DLBCL组织中的表达分析研究较少。本研究结果发现，Bax阳性率为32.05%，显著低于反应增生性淋巴结组织样本中的阳性表达率，且与临床分期相关，说明Bax也可能参与DLBCL的发生，促进DLBCL的发展。

进一步经相关性分析发现，NF-κB/p65与Bcl-2呈正相关，NF-κB/p65与Bax呈负相关，Bcl-2与Bax呈负相关。NF-κB/p65与Bcl-2呈正相关原因可能在于Bcl-2是NF-κB/p65下游关键靶蛋白之一［19］。Bcl-2与Bax呈负相关原因可能在于Bcl-2可阻止细胞色素c释放，而Bax可促进细胞色素c释放，细胞色素c一旦释放便与caspase-9、细胞凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合形成凋亡酶，激活 caspase-3而启动凋亡［20］。Bcl-2、Bax的平衡是以上效应是否发生的关键所在，随着Bcl-2蛋白表达增多，Bax/Bax同源二聚体逐渐转化为Bax/Bcl-2异源二聚体，由诱导细胞凋亡转化为促进细胞凋亡，Bcl-2、Bax 两者对凋亡起到正负调控作用［21］。延长患者生存期是DLBCL治疗的最终目的，朱斌等人［17］发现 NF-κB/p65 阳性表达患者 2 年总生存率25.0%，明显低于阴性表达者的68.8%。糜公仆等人［12］研究发现Bcl-2阳性表达者3年总生存率56.25%，低于1年总生存率75%。以上结果提示NF-κB/p65和Bcl-2阳性表达会对患者生存率产生影响，但上述研究观察时间均较短。本研究则对所有患者进行为期5～53个月的随访，并进行Kaplan-Meier生存曲线分析，结果显示NF-κB/p65或Bcl-2阳性表达可降低生存率，而Bax阳性表达可提高生存率。这是由于NF-κB/p65、Bcl-2阳性表达可抑制癌细胞凋亡，延长癌细胞寿命，预后不佳，而Bax阳性表达可促进癌细胞凋亡，阻止DLBCL进一步发展，进而延长患者生存期。

综上所述，NF-κB/p65、Bcl-2和 Bax表达可在一定程度上反映DLBCL生物学异质性及临床特征，对DLBCL预后产生一定影响，可作为DLBCL诊疗及预后评估的参考指标。